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【摘要】 目的 考察龙胆野生品与人工种植品中龙胆苦苷含量的差异。方法 采用以咖啡因为内标物的高效液相色谱内标法[1]。结果 随着龙胆生长年限的增长，其中的龙胆苦苷含量也在增加，三年人工种植品的含量才基本接近野生样品的含量。结论 为保证龙胆药材的质量，保护中药材资源，人工种植龙胆势在必行。
【关键词】 高效液相色谱;内标法;咖啡因;龙胆;龙胆苦苷;含量测定
龙胆系龙胆科多年生草本植物, 2005版《中华人民共和国药典》收载入药品种有4种，分别是条叶龙胆、龙胆、三花龙胆或坚龙胆。主要以根入药,属大宗常用中药材，主要有效成分为龙胆苦苷，有泻肝胆实火,除下焦湿热的功能[2]。过去三十几年一直列入国家和省管理的统配品种，为长期供不应求和大量收购的品种。近年来，由于盲目采挖使野生资源遭到严重破坏，野生资源日趋枯竭，产量和质量逐年下降，因此开发人工种植前景十分广阔[3]。
本文采用2005版《中国药典》规定方法，以咖啡因为内标物的高效液相色谱内标法，对贵州几个地区龙胆野生品与人工种植品中的龙胆苦苷进行含量测定，为龙胆野生品转为人工种植提供参考依据。
1 仪器、试剂与药材
1.1 仪器与试剂 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，紫外检测器，柱温箱;AE-240双量程电子分析天平，量程：万分之一和十万分之一两档(梅特勒-托利多上海有限公司);甲醇为分析纯，水为娃哈哈纯净水;龙胆苦苷对照品和咖啡因对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：110770-200510、171215-200406)。
1.2 药材 分别采自贵州省龙里县以及贵阳市郊乌当。经我院付智明讲师鉴定均为龙胆科(Gentianaceae)植物坚龙胆(Gentiana rigescens Franch.)，本实验均用其根作含量测定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX Extend-C18 4.6mm×250mm, 5μm;流动相为甲醇-水(3:7);柱温25℃;检测波长：270nm;分离结果见图1。(a)咖啡因 (b)龙胆苦苷 图1 龙胆药材供试液加咖啡因内标(A)、 龙胆苦苷对照品加咖啡因内标(B)色谱图
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品8.73mg用甲醇溶解并定容至20ml，即得浓度为436.50μg/ml的对照品溶液。
2.2.2 内标溶液的制备 精密称取咖啡因对照品45.01mg用甲醇溶解并定容至50ml，即得浓度为900.20μg/ml内标溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取经60℃干燥至恒重的样品粉末约0.1g，置于50ml具塞锥形瓶中，精密加入10ml甲醇，密塞，时时振摇，置于暗处冷浸12h。过滤，弃去初滤液取续滤液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液1ml和浓度为900.20μg/ml内标溶液1ml于5ml容量瓶中，甲醇定容至刻度摇匀即可进行测定。
2.3 标准曲线的制作 分别精密吸取浓度为436.50μg/ml的对照品溶液1，1.5，2， 2.5，3，3.5，4ml于7个5ml的量瓶中，再分别精密加入浓度为900.20μg/ml的内标溶液1ml，甲醇定容至刻度并摇匀。用上述色谱条件对各浓度进行测定，以龙胆苦苷和内标物的峰面积比值A为纵坐标，龙胆苦苷浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程：A = 4.6587 C + 0.0051，r = 0.99993 表明当内标物浓度为180.04μg/ml时，龙胆苦苷浓度在87.30～349.20μg/ml范围内线性关系良好。
2.4 精密度考察 分别精密吸取龙胆苦苷对照品溶液和内标液各1ml，用甲醇定容至5ml，按上述色谱条件连续测定6次，用龙胆苦苷对照品和内标物峰面积比值计算精密度，得RSD=1.40%。
2.5 稳定性考察 用2.2.3“供试品溶液的制备项”所制得的供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，4，8，12，16，20h进行测定，用龙胆苦苷和内标物峰面积比值计算，得RSD为1.20%。结果表明龙胆苦苷溶液在20h内稳定。
2.6 重复性实验 精密称取2007年11月17日采收的乌当龙胆样品粉末6份，每份约0.1g，按2.2.3“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果龙胆苦苷平均含量为4.71%，RSD为1.68%(n = 6)。
2.7 加样回收率试验 精密称取已知龙胆苦苷平均含量为4.71%的龙胆样品粉末6份，每份约0.05g，分别精密加入用甲醇配制成浓度为236μg/ml的龙胆苦苷对照品甲醇溶液10ml，按2.2.3“供试品溶液的制备”项下进行提取，按上述色谱条件进行分离测定，结果见表1。表1 加样回收率实验结果
2.8 样品含量测定 精密称取各样品粉末约0.1g，按2.2.3“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，并按上述色谱条件进行测定，用龙胆苦苷和内标物的峰面积比值代入上述回归方程进行计算，结果见表2。
3 讨论
3.1 由大方和乌当两地人工种植品中龙胆苦苷含量测定结果可以看出，随着生长年限的增长，龙胆苦苷含量逐渐增加。野生龙胆通常不知道其生长年限，通过与大方、乌当两地人工种植的龙胆中龙胆苦苷含量进行比较，3年人工种植品中龙胆苦苷的含量才基本接近野生龙胆的含量，因此我们所采的野生龙胆的生长年限应该在3年或3年以上。可以看出，对野生龙胆的滥采滥挖，不仅龙胆原料药材的质量难以保证，又对资源造成较大破坏，所以人工种植龙胆势在必行。表2 龙胆苦苷含量测定结果
3.2 由表2可以看出 龙胆苦苷的含量在11月会出现降低的现象，12月份又明显增高，这种现象可能与气候变化有关，所以，根据分析结果，最佳采收时间选择9月份或12月份较好。
3.3 本实验所采用的以咖啡因为内标物的高效液相色谱法是根据2005版《中国药典》对龙胆药材中龙胆苦苷含量测定的方法，该方法操作较为实用和简便。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典(一部).北京:化学工业出版社,2005，64.
2 刘涛, 才谦,付玉芹,等.中药龙胆的研究进展.辽宁中医杂志,2004,31(1):85-86.
3 张海洋,张守平.龙胆草的价值与栽培技术.特种经济动植物,2002,(8):28-29.