点击显示 收起
关键词 单纯疱疹病毒，Ⅱ型；梅毒螺旋体；双引物聚合酶链反应；快速检测
摘要 目的 建立双引物聚合酶链反应（PCR）用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法 基于单纯疱疹病毒II型（HSV-2）的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列，自行设计2对特异性寡核苷酸引物，建立了同时检测上述2种病原体的双引物PCR。结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA，即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15.7%，双引物PCR阳性检出率为19.6%；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。HSV阳性培养率23.6%，双引物PCR阳性率47.1%，双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义（P=0.019）；上述临床标本分别进行了2种病原体的单引物PCR，与双引物PCR对照结果完全一致。结论 我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体，且有快速、敏感、特异以及简便的特点。
SIMULTANEOUS EXAMINATION OF HERPES SIMPLEX VIRUS Ⅱ AND TREPONEMA PALLIDUM BY DOUBLE-PRIMER PCR
Liu Aiying,Yin Yueping.
Department of Dermatology and Venereal Disease,Coal General Hospital,Beijing 100028，China
Key words herpes simplex virus; treponema pallidum; double-primer PCR; fast detection
Abstract Objective To approach double-primer PCR assay for simultaneous detection of Herpes simplex virus Ⅱ(HSV-2) and Treponema pallidum. Methods According to specific gene sequence of herpes simplex virus Ⅱ DNA Polymerse gene and treponema pallidum 47 kd gene, 2 sets of specific primers were designed and a double-primer PCR assay were developed to detect 2 agents in one test. Results The target DNAs of 2 agents were specifically amplified by theirs specific primers. The DNA fragment length of amplifying HSV-2 was 202 bp, amplifying treponema pallidum was 252 bp; The DNA of other 11 common microbes of genital tract and human gene were not amplified by 2 sets of primers. 51 clinical samples were detected by dark-field microscopy and a double-primer PCR, the positive rates were 15.7% and 19.6%, respectively. And there was no statistically significant different between dark-field microscopy and a double-primer PCR (P>0.05). Detected by HSV culture and a double-primer PCR, the positive rates were 23.6% and 47.1% respectively. The sensitivity of HSV detected by PCR and a double-primer PCR was significantly higher than that of culture, and there was significant different between HSV culture and PCR and a double-primer PCR (P=0.019). All specimens were tested for HSV and Treponema pallidum by single-primer PCR respectively, the results were consistent to double-primer PCR. Conclusion Primary study indicates that the double-primer PCR assay can simultaneously, specifically, rapidly, sensitively detect 2 agents.
梅毒与生殖器疱疹均为我国常见的性传播疾病，其病原体梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ主要通过生殖器部位皮肤粘膜的微小损伤而传染，二者均可复发，均可产生生殖器溃疡或呈隐性感染，二者易同时并发感染，临床上需排除诊断，即分别进行梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒检查。传统的病原学实验室诊断方法大多耗时长、敏感性差及操作技术要求高［1］。 近年来发展的DNA扩增技术如聚合酶链反应（PCR）可直接检测病原体，且较其他方法敏感性和特异性高，但一次只能检测出一种病原体，不利于对混合感染的检测，而且操作过程相对费时，成本高。因此我们建立了双引物PCR，以实现敏感、特异、快速简便的同时检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 标准株 HSV-2 333株和梅毒螺旋体Nichols株，均由中国医学科学院皮肤病研究所性病实验室提供。
1.1.2 其他生殖道和正常皮肤常见微生物及正常人的基因组DNA 包括杜克雷嗜血杆菌、沙眼衣原体株、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、阴道毛滴虫及淋病双球菌的基因组DNA由中国医学科学院皮肤病研究所相关科室提供；正常人的基因组DNA由上海博星公司提供。
1.1.3 临床标本来源和采集 选择2004年7—11月我院性病门诊连续就诊患者，要求入选病例为临床上有生殖器部位水疱或溃疡，且在取材前2周内未使用过药物的患者。每位患者损害部位标本，分别进行常规暗视野显微镜检查和HSV细胞培养。
1.2 实验方法
1.2.1 各病原体引物的设计 选择HSV-2的DNA聚合酶特异基因和梅毒螺旋体47kD膜蛋白特异基因，用计算机软件Primer Premier 5.0查阅设计相应病原体特异引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，GenBank检索未见非特异性匹配的其他微生物DNA。
表1 各病原体引物序列及相关参数（略）
1.2.2 各病原体及临床标本基因组DNA的制备 采用瑞士Roche公司标本处理试剂盒。抽提具体方法见试剂盒操作说明。并将各标准株的DNA提取物用双蒸水稀释后，置于紫外分光光度仪上进行DNA浓度测定。
1.2.3 双引物PCR扩增反应 反应体系包括引物各40pmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，dNTP 250μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5U，模板DNA1μl，10×PCR缓冲液2.5μl，补水至25μl。PCR反应程序：95℃ 5min ；95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s；35个循环；72℃ 10min。
1.2.4 单引物PCR扩增反应 梅毒螺旋体单引物PCR反应体系及条件见文献［2］，扩增产物大小为260bp；单纯疱疹病毒单引物PCR反应体系及条件见文献［3，4］，扩增产物大小为241bp。
1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 配制2.5%琼脂糖凝胶，加溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml。用1×TBE作为电泳缓冲液，Marker DL2 000分子量作为标准对照。取6μl PCR扩增产物，加3μl上样缓冲液，电压150V，30min，FR-200凝胶成像仪观察同时热敏仪打印结果。
2 结果
2.1 各病原体引物PCR扩增的特异性 分别以病原体HSV-2和梅毒螺旋体的DNA为模板做双引物PCR（图1），结果只在相应处出现一条带，在分别以其他生殖道常见病原体及正常人基因组DNA为模板进行PCR，结果均无扩增带。另外在同一管内同时扩增上述2种病原体DNA及其他病原体DNA和正常人的基因组DNA，结果仅见相应的2条DNA条带，均未见其他DNA条带（图2）。
M: DNA Marker DL2 000,参考片段（bp）从上到下分子量分别为：2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100；1：阴性对照；2：梅毒螺旋体；3：单纯疱疹病毒
图1 双引物复合PCR分别扩增二种病原体DNA的电泳结果（略）
2.2 各病原体DNA扩增的敏感性 将提取的2种病原体DNA连续10倍稀释至0.0012ng/μl，各稀释度取1μl液体进行PCR扩增，电泳后可检测的DNA最低量为0.012ng。
2.3 各病原体引物的相关性 将2对特异性引物按所需扩增浓度混合后，加入上述双引物PCR扩增体系中进行扩增，该体系中不加任何病原体DNA，结果未见任何扩增条带，而阳性对照出现特异性2条扩增条带，可表明引物之间不会因相互扩增而出现假阳性结果。
1：从上到下分别为梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒，2：阴性对照
图2 双引物复合PCR同时扩增二种病原体DNA的电泳结果（略）
表2 双引物PCR和暗视野显微镜检查检测结果比较（略）
注：阳性率比较P=0.6034
表3 HSV培养和双引物PCR检测结果比较（略）
注：阳性率比较P＜0.05
2.4 临床标本的检测结果 见表2和表3。51例患者中，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查8例阳性，阳性检出率15.7%；双引物PCR检测10例阳性，阳性检出率19.6%；其中1例暗视野显微镜检查阳性而双引物PCR阴性，3例双引物PCR阳性而暗视野显微镜检查阴性；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。HSV培养12例阳性，阳性检出率23.6%；双引物PCR检测24例阳性，阳性检出率47.1%；其中1例HSV培养阳性而双引物PCR阴性，13例双引物PCR阳性而培养阴性；双引物PCR法阳性检出率显著高于HSV培养法且差异有统计学意义（P<0.05）。1例复合感染，其余15例未检测出这2种病原体。上述所有标本分别使用已被证实且被多个实验室采用的2种病原体的单引物PCR，与双引物PCR对照，结果完全一致。
3 讨论
混合感染和隐性感染是性病防治的重点和难点，尤其是混合隐性感染，不仅造成漏诊漏治，而且是性病传播的主要传染原，也是性病预防和治疗困难的主要原因之一。已有研究［5，6］证实单纯疱疹病毒易与梅毒螺旋体混合感染，生殖器溃疡可能有助于梅毒螺旋体或单纯疱疹病毒进入对方体内，从而产生混合感染，临床上需排除诊断，即对典型梅毒患者也需检查HSV-2，排除HSV隐性感染。因此为同时对梅毒螺旋体和HSV感染作出准确诊断，探索一种快速、敏感、特异的方法具有重要意义。多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新型的PCR扩增技术。可以在同一密闭的反应体系中应用多对引物来扩增多个不同目的基因。该技术除具有普通PCR的特点外，主要优点是多对引物同时扩增，扩增结果的阳性及阴性条带可互为对照，进一步排除了PCR假阳性、假阴性问题，且较多次单引物PCR扩增所用试剂少、时间短、通过一次扩增反应可得到多方面的信息。本研究建立的双引物PCR检测了51份临床标本，与梅毒螺旋体暗视野显微镜结果进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与HSV培养结果进行比较，双引物PCR法阳性检出率显著高于HSV培养法且差异有统计学意义（P=0.019）。另有个别病例出现差异，可能原因：①取材不当或标本中含有Taq DNA聚合酶抑制物质，从而造成PCR假阴性；②HSV培养敏感性低，导致PCR阳性而培养阴性结果。所有临床标本分别使用已被证实且被多个实验室采用的2种病原体的单引物PCR进行检测，与本研究建立的双引物PCR比较对照，结果一致。
4 参考文献
［1］ Bruisten SM,Cairo I,Fennema H,et al.Diagnosing genital ulcer disease in a clinic for sexually transmitted disaese in amsterdam,the netherlands［J］.J Clin Microbiol,2001,39(2):601-605
［2］ Orle KA,Weiss JB.Detection of haemophilus ducreyi, treponema papllidum, and herpes simplex virus by multiplex PCR［M］//Peeling RW,Sparling PF,ed.Sexually transmitted diseases:methods and protocols. Humana Press,1999：67-79
［3］ Safrin S,Shaw H,Bolan G,et al.Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection［J］.Sex Transm Dis,1997,24:176-180
［4］ 赖伟红，韩国柱，钟铭英，等.单纯疱疹病毒的聚合酶链反应-微孔板反向杂交检测和分型［J］.中华皮肤科杂志，2000，33(3)：191-192
［5］ 黎兆军，卢荣熙，黄文明，等.梅毒患者合并II型单纯疱疹病毒感染的研究［J］.中华皮肤科杂志，1998，31(3)：178
［6］ Ahmed HJ,Mbwana J,Gunnarsson E,et al.Etiology of genital ulcer disease and association with human immunodeficiency virus infection in two tanzanian cities［J］.Sex Transm Dis,2003,30(2):114-119
100028 北京市，煤炭总医院皮肤性病科
中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所