点击显示 收起
关键词 载脂蛋白E；脑血管病；聚合酶链反应；限制性片段长度；基因多态性
载脂蛋白 E (Apolipoprotein E,ApoE)基因多态性与脑血管病发病遗传易感性的关系是近年临床研究的焦点。ApoE是一种具有多态性的脂蛋白，有三种异构体E2、E3和E4,分别由第19号染色体上的三种等位基因E2、E3和E4编码。它参与机体脂质代谢及调节胆固醇水平，是动脉粥样硬化病变发生、发展的遗传因素之一，但是目前研究结果并不一致，为了明确ApoE基因多态性与脑血管病的关系，我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术分别对脑血管病患者和正常人ApoE基因多态性进行了检测，常规检测血脂水平。
1 资料与方法
1.1 研究对象 脑血管病组：脑梗死51例，脑出血50例，年龄41~78岁，平均（59±15）岁，均为2001—2003年我院神经内科住院患者，脑血管病诊断均符合全国第四届脑血管病会议标准［1］，经头CT或MRI确诊，并排除心肝肾疾病、糖尿病、甲状腺疾病、血管性痴呆及Alzheimer病。对照组：体检健康无血缘关系的献血者69例，平均年龄（34±5.5）岁。
1.2 研究方法
1.2.1 血脂检测 血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）均采用酶法测定，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）用磷钨酸镁沉淀法测定，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）按公式计算：即LDL-L=TC-(TG/2.2+HDL-L)。
1.2.2 ApoE基因多态性检测 ①DNA的抽提：空腹抽取静脉血5ml，用低渗溶血，酚/氯仿法抽提基因组DNA，加适量TE缓冲液溶解后作为PCR模板。②聚合酶链反应（PCR）方法操作如下：引物设计［2］：P1：5′-ACA GAA TTC CGC CCC GGC CTG GTA CAC-3′：5′-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3′，扩增载脂蛋白E基因上的244bp，PCR反应总体积为20μl，其中包括10×缓冲液（buffer）2μl，25mM MgCl2 2μl，4×dNTP1.6μl,P1和P2各1μmol，Taq DNA聚合酶2U,DNA模板2μl,无菌双蒸水至总体积20μl，进行PCR扩增，94℃ 7min预变性，94℃变性1min→60℃ 45s→72℃延伸2min，进行循环，共30次，最后再72℃延伸7min。扩增产物中加入HhaI酶2μl及其缓冲液6μl，置于37℃水浴锅4~5h，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、银染分离酶切产物，以pBR 322DNA/Hae Ⅲ为分子标记物，发现有五种可见片段：E3/3:91bp,48bp,35bp;E2/2:91bp,83bp;E4/472bp,48bp,35bp;E2/391bp,83bp,48bp,35bp;E3/4:91bp,72bp,48bp,35bp;E2/4:91bp,83bp,72bp,48bp,35bp。
1.3 统计学方法 资料分析采用SPSS软件处理，采用χ2检验;方差分析q检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 脑血管病组和对照组ApoE基因型及等位基因频率比较 结果见表1,170例受检者（脑血管病组101例，对照组69例）的ApoE基因型为5种基因型和3种等位基因频率。经χ2检验，对照组与脑血管病组ApoE基因型分布均处于Heirdy-Weinbery平衡之中（P＞0.05）。脑梗死组ApoE基因型频率与对照组比较有统计学意义（P<0.05），其中E3/4基因型和E4等位基因频率明显高于对照组，脑出血组与对照组略有不同，但无统计学意义（P＞0.05）。
表1 各组ApoE基因型、等位基因频率分布（略）
注：与对照组比较，*P<0.05
2.2 脑梗死组、脑出血组与对照组血脂水平的关系 结果见表2， ①脑梗死组TC、TG及LDL-C水平明显高于对照组，HDL-C水平明显低于对照组，二组比较差异有统计学意义（P<0.05）,脑出血组与对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。
表2 二组病例与对照组血脂水平的比较（略）
注：与对照组比较，*P<0.05
2.3 ApoE不同基因型对血脂的影响 结果见表3,因E2/2和 E2/4基因型例数较少，将5个基因型并为3组：E2/2+E2/3、E3/3、E2/4+E3/4。E3/4+E2/4组总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平高于其他基因型组差异有统计学意义（P<0.05）。高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平低于其他基因型组差异有统计学意义（P<0.05）。脑出血组Apo E基因型之间差异无统计学意义。
表3 脑梗死组各ApoE基因型血脂水平的比较（略）
注：与E2/4+E3/4比较，*P<0.05
3 讨论
ApoE基因呈多态性变化，其中有6种ApoE表型，即三种纯合子（E2/2、E3/3、E4/4）和三种杂合子（E2/3、E2/4、E3/4），人群中最常见的等位基因是E3，最常见的表型是ApoE3/3。据报道［3］，健康人群中的6种基因型分布不均衡，E3/3发生频率最高，其次为E3/4、E2/3、E2/4、E4/4，E2/2发生频率最低。目前，国内外对ApoE基因多态性与脑血管病关系的研究日趋增多，但结果不一。有人认为E4是脑梗死的易感因子［4］，脑出血的危险因素［5］。但也有研究未发现脑梗死和脑出血患者与对照组之间差异有统计学意义［6］。本研究以唐山汉族人为背景进行了研究，结果显示，脑梗死的基因频率、等位基因分布均与对照组比较差异有统计学意义，E3/4基因型、等位基因频率均高于对照组，与夏昱等［7］研究结果一致。提示ApoE等位基因E4与脑梗死关系密切，是一种遗传易感性因子。而脑出血组E4、E2等位基因频率虽高于对照组，但无统计学意义，与肖志杰等［8］研究结果一致。另外，我们进一步探讨了ApoE基因型对血脂水平的影响与脑血管病之间的关系，结果发现脑梗死患者ApoE基因型和TC、LDL-C水平均高于对照组，HDL-C水平低于对照组，提示载脂蛋白 E对血脂水平有一定的影响。而与脑出血患者未能肯定其关系，显示了脑出血是多危险因素疾病，可能脑出血的危险因素是多元性因素所引起的，有必要进一步研究。
4 参考文献
［1］ 中华神经科学会、中华神经科外科学会.脑血管疾病分类（1995）［J］.中华神经科杂志，1996，29(6)：376-380
［2］ James E,Hixson,Daniel T.Vernier.Note on methodolgy:restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplietion and cleavage with Hha I［J］.J Lipid Res，1990，31:545-548
［3］ Siest G,Pillot T,Regis-Bailly A,et al.Apolipoprtein E:an important gene and protein to follow in laboratory medicine［J］.Clin Chem,1995,41:1068-2086
［4］ Chwdhury AH,Yokoyama T,Kokubo Y,et al.Apolipoprotein E genetic polymorphism and stroke subtypes in a Bangladeshr hospital-based study［J］.J Epidemiol,2001,11:131-138
［5］ Kokubo Y,Chowdhury AH,Date C,et al.Age-dependent association of apolipoprotein E genotype with stroke subtypes in a Japanese rural population［J］.Stroke,2000,31:1299-1306
［6］ Nanta Y,Katsuya T,Rakugi H,et al.Polymarphism of angiolensin converting enzyme,angiotensiogen and apolipoprotein E genes in a Japanese population with cerbrovascular disease［J］.Am J Hypertens，1997,10:1391-1395
［7］ 夏昱，李红乐，王继立.载脂蛋白E多态性与脑梗死及脂类代谢关系的研究［J］.中国病理生理杂志，2002，18（7）：826-829
［8］ 肖志杰，赵水平，聂赛，等.载脂蛋白E多态性和脑出血关系的研究［J］.脑与神经疾病杂志，2004，12（3）：185-187
063000 河北省唐山市工人医院中心实验室
唐山市工人医院神经内科