齐墩果酸抑制高脂饮食肥胖大鼠体重的实验研究

【摘要】  目的 观察齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠的影响并初步探讨其作用机制。方法 SD大鼠44只随机分为正常对照组、高脂饮食组、高脂饮食+齐墩果酸低[20 mg/(kg·d)]、中[40 mg/(kg·d)]、高[80 mg/(kg·d)]剂量组。每天定时灌胃,记录进食量,每周定时称体重1次。8周末股动脉采血,测血清生化指标。结果 给予高脂饮食后大鼠体重明显增加,血清瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)、游离脂肪酸(FFA)和低密度脂蛋白(LDL)增加,高密度脂蛋白减少(HDL),血清谷丙转氨酶(GPT)和丙二醛(MDA)升高。高脂饮食大鼠给予齐墩果酸后,体重减轻,血清瘦素、FFA降低,MDA减少,总抗氧化能力(TAOC)增高。结论 齐墩果酸可明显抑制高脂饮食大鼠的体重增加。其作用可能是通过降低血清瘦素水平,改善体内脂肪代谢,提高机体的抗氧化能力实现的。

【关键词】  齐墩果酸;肥胖;体重;瘦素;抗氧化能力

Inhibitory effect of oleanolic acid on body weight of obese rats fed with highfat diet

　　LIN Meiling1,2,CHEN Hongmei1,2,ZHANG Xiaoyu1,2,LI Wei1,2,QU Songyi1,2,ZHENG Tianzhen1,2

　　(1.Institute of Physiology and Psychology,School of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

　　【Abstract】 Objective To study the effects of oleanolic acid on rats fed with highfat diet and discuss its mechanisms.Methods Fortyfour healthy male SD rats were randomly divided into five groups:control group,highfat diet group,highfat diet plus low,medium and high doseoleanolic acid group[20,40 and 80 mg/(kg·d)respectively].Food intake was monitored daily,and body weight was weighed weekly at set time.Eight weeks later,the rats were sacrificed to collect blood for the measure of the levels of serum biochemical indicator.Results Compared with control group,body weight,the levels of serum leptin,resistin,interleukin 6(IL6),free fatty acids(FFA),glutamatepyruvate transaminase(GPT),lowdensity lipoprotein(LDL)and malondialdehyde(MDA)increased while serum levels of highdensity lipoprotein(HDL)and total antioxidant capacity(TAOC)reduced in highfat diet group.Oleanolic acid lowered body weight,serum leptin,FFA and MDA,elevated the levels of serum TAOC.Conclusion Oleanolic acid can significantly inhibit body weight gain of highfat diet obese rats.Its mechanism may be involved in decreasing the level of serum leptin,improving fat metabolism and increasing antioxidation capability.

　　【Key words】 oleanolic acid;obesity;body weight;leptin;antioxidant capacity

　　肥胖症成因复杂,危害严重,可引起多种疾病和严重的并发症,被世界卫生组织认定为影响健康的第五大危险因素。在引起肥胖的诸多因素中,高脂饮食一直备受关注。如何有效减轻体重,限制和减少肥胖并发症的发生,成为研究热点[1]。齐墩果酸(oleanolic acid,OA)为五环三萜类化合物,广泛存在于食物、药用植物和其他植物中[2]。目前发现齐墩果酸的药理作用主要集中在护肝解肝毒、抗溃疡、降糖、降脂、抗高血压、强心、抗癌和抗氧化等方面[3],但其对肥胖影响的研究国内外未见报道。本研究旨在观察齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠的影响并初步探讨其作用机制,以期为其在减少肥胖方面的应用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康雄性SD大鼠,断乳后10 d,体重(99.57±2.13)g,上海斯莱克实验动物有限公司提供,合格证号:SCXK(沪)20030003.

　　1.2 饲料与试剂

　　基础饲料:苏州双狮实验动物饲料科技有限公司,所含热量为3 479 kcal/kg;高脂饲料:本实验室自行配制,所含热量为4 721.6 kcal/kg;齐墩果酸(oleanolic acid),陕西旭煌植物科技发展有限公司(纯度98%)提供,批号:070510;瘦素(leptin)测定试剂盒,批号:550011;抵抗素(resistin)测定试剂盒,批号:774008,由BBridge International Inc公司提供;肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factoralpha,TNFα)测定试剂盒,批号:20070915;白介素6(interleukin6,IL6)测定试剂盒,批号:20070715,由深圳晶美生物工程有限公司北京分公司提供;丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒,批号:20070806;总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)测定试剂盒,批号:20070806,由南京建成生物工程研究所提供;血脂测定试剂盒,批号:070411;谷丙转氨酶(glutamatepyruvate transaminase,GPT)测定试剂盒,批号:070424;谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,GOT)测定试剂盒,批号:070806,由广州标佳科技有限公司提供。

　　1.3 方法

　　SD大鼠44只,随机分为正常对照组10只、高脂饮食组10只、高脂饮食+齐墩果酸低[20 mg/(kg·d)]、中[40 mg/(kg·d)]、高[80 mg/(kg·d)]剂量组各8只。正常对照组给予基础饲料,其余各组给予高脂饲料。正常对照组和高脂饮食组于每晚8时左右给予3 ml 生理盐水灌胃,其余各组依次给予同等量分别含12.5、25、50 mg/(kg·d)的齐墩果酸灌胃,维持至第八周。记录每只大鼠日进食量(g),每7 d测体重1次(g)。实验至8周末,空腹12 h,正常对照组、高脂组、齐墩果酸低剂量组动物经动脉取血收集血清。酶联免疫吸附剂测定法检测瘦素、抵抗素、TNFα;TBA比色法测定血清MDA及比色法测定血清TAOC水平;用一次提取比色法测定血清游离脂肪酸(free fatty acid,FFA);速率法测定GPT和GOT;氧化酶法测定甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)。

　　1.4 统计学分析

　　采用SPSS 13.0 统计软件对数据处理,实验结果以±s表示,采用单因素方差分析,P<0.05被认为有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠体重的影响

　　与正常对照组相比,高脂饮食组大鼠体重自第二周开始明显高于对照组。给予不同剂量齐墩果酸后,均可明显抑制高脂饮食大鼠体重的增加,低、中、高剂量对高脂饮食大鼠体重的增加的抑制作用没有明显差异(表1)。表1 给药8周各组大鼠体重的比较(g)

　　2.2 齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠血清瘦素、抵抗素、TNFα水平的影响

　　与正常对照组相比,高脂饮食组大鼠血清瘦素、抵抗素明显升高,而TNFα变化不大。低剂量齐墩果酸组瘦素水平明显降低(表2)。表2 给药8 w后各组大鼠瘦素、抵抗素、TNFα、IL6的比较

　　2.3 齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠血清TG、TC、HDL、LDL、FFA水平的影响

　　与正常对照组相比,给予高脂饮食后大鼠血清FFA、LDL升高,HDL降低,TC、TG无明显变化。低剂量齐墩果酸组FFA降低,其他指标均无明显变化(表3)。表3 给药8 w后各组大鼠FFA、TC、TG、HDL、LDL的比较(±s)a:P<0.05,b:P<0.01,vs control group(NC);f:P<0.001,vs highfat diet group(HFC)

　　2.4 齐墩果酸对高脂饮食肥胖大鼠血清GPT、GOT、MDA、TAOC水平的影响

　　与正常对照组相比,给予高脂饮食后大鼠血清GPT、MDA升高,TAOC降低。低剂量齐墩果酸组GPT、MDA降低,TAOC升高(表4)。表4 给药8 w后各组大鼠TAOC、MDA、GPT、GOT的比较(±s)a:P<0.05,c:P<0.001,vs control group(NC);d:P<0.05,f:P<0.001,vs highfat diet group(HFC)

　　3 讨论

　　肥胖成因复杂,除与遗传因素、激素水平相关外,饮食影响是最为显著的影响因素。高脂饮食引起体重增加的同时造成多种血清生化指标的改变,从而加重肥胖。

　　瘦素(leptin)是由ob基因编码的多肽激素,主要由白色脂肪组织分泌。其主要作用是将营养状况信号传至中枢神经系统或外周器官,产生饱感,引起动物摄食减少,增加能量消耗[4];促进脂肪酸的氧化分解和葡萄糖的吸收利用,抑制非脂肪组织的脂类积聚,避免“脂毒性”所导致的功能性损害[5]。瘦素的表达和分泌与脂肪含量及肥胖程度相关[6]。饱食和肥胖是诱导瘦素表达的重要因素,而禁食则降低瘦素的表达及抑制其分泌。人类肥胖者循环瘦素水平是增加的,现在认为可能是存在瘦素抵抗的缘故。研究表明,细胞因子信号抑制子3(suppressor of cytokine sigaling3,SOCS3)表达增加,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B,PTP1B)功能异常[7],可能是造成瘦素抵抗的原因。一般认为瘦素抵抗继发于肥胖,但是最近Scarpace等[8]的研究结果显示,瘦素自身可以引起瘦素抵抗诱发肥胖,肥胖的发生又加重瘦素抵抗的程度。本实验中高脂饮食组大鼠血清瘦素水平明显高于正常对照组,说明高脂饮食肥胖大鼠体内可能存在着瘦素抵抗,而高脂饮食+齐墩果酸组,血清瘦素水平明显低于高脂饮食组,接近正常对照组,说明齐墩果酸减轻高脂饮食造成的体重增加可能是通过降低血清瘦素水平,改善瘦素抵抗而发挥作用。

　　抵抗素是2001年由美国宾夕法尼亚州大学医学院科学家Steppan等[9]发现的一种由脂肪细胞分泌的激素。人抵抗素基因在脂肪细胞、胎盘及血液单核细胞中均有表达[1011],啮齿类动物抵抗素主要由脂肪细胞特异性分泌。目前研究认为抵抗素的生理作用主要与胰岛素抵抗有关。研究表明,抵抗素可诱导3T3L1脂肪细胞表达SOCS3增加、促进SOCS3与胰岛素受体(insulin receptor,IR)竞争性结合。抵抗素高表达动物模型的脂肪组织也存在着胰岛素受体底物(IRS1)与IRS2蛋白含量减少、酪氨酸残基磷酸化水平降低、蛋白激酶B(Akt)以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活减少等,从而导致胰岛素抵抗[12]。Sagawa 等[13]报道严重肥胖的人的脂肪组织抵抗素mRNA水平显著增高。高抵抗素使肝脏中胰岛素对AMPK的激活作用减弱,IRS2蛋白含量减少及酪氨酸残基磷酸化水平降低,而使参与糖异生的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸酶表达增加,胰岛素对肝糖生成的抑制作用减弱最终导致肝糖产生增加[14]。本实验研究发现,高脂组大鼠抵抗素的水平明显高于对照组,这与血清抵抗素浓度和体内脂肪百分比呈正相关的报道一致[15],说明肥胖可以导致血清抵抗素浓度的增加。齐墩果酸组虽然抵抗素水平较高脂组有所下降,但并未表现出统计学差异,表明齐墩果酸对高脂肥胖的改善作用,并不是通过降低血清抵抗素水平而发挥作用。

　　肥胖是一种慢性炎症。肿瘤坏死因子α(TNFα)是脂肪组织分泌的众多细胞因子之一,脂肪组织巨噬细胞是脂肪组织TNFα的主要来源,Weisberg等[16]的研究显示,肥胖时脂肪组织巨噬细胞的含量与体脂块大小、脂肪细胞大小及体重指数(body mass index,BMI)高度相关,所以,肥胖者脂肪组织TNFα mRNA表达和TNFα蛋白含量均增高。而关于血清TNFα水平的研究却有差异[17] 。有研究表明[18],肥胖者血TNFα水平增高,与肥胖呈低度相关。但有研究显示[19],肥胖者动脉血通过脂肪组织前后的TNFα水平无改变,提示脂肪组织产生的TNFα不释放或很少释放入血。因此,脂肪组织产生的TNFα对血清TNFα水平的影响不大。本实验中,高脂饮食组大鼠血清TNFα无增高,与近期关于人肥胖[20]的研究结果一致。而血液中单核细胞活性状态的不同,可能是造成不同研究中血清TNFα水平存在差异的原因。有研究表明[21],齐墩果酸可以使小鼠巨噬细胞中TNFα和NO释放减少,从而发挥抗癌作用,但本实验中并未看到齐墩果酸对TNFα合成释放的影响,可能与研究对象不同有关。

　　实验中发现,高脂饮食组大鼠血清游离脂肪酸(FFA)升高,高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)降低,低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)升高,但甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)没有明显变化,长期高脂饮食造成肥胖动物血脂代谢紊乱。肥胖患者脂肪堆积,脂肪组织激素敏感性脂肪酶(hormonesensitive lipase,HSL)活性及HSL mRNA表达增加[22],脂肪分解活跃,产生高FFA。血浆胆固醇以脂蛋白的形式存在,其中60 %～70 %存在于LDL中。近年研究表明[2324],以LDLC 增高为主的Ⅱ型高脂血症能明显促进动脉粥样硬化(AS)发生。HDLC则参与胆固醇的逆向转运,即将外周组织胆固醇转运至肝脏进行代谢和排出体外,具有降低血中胆固醇的作用,故HDLC是重要的抗AS因子。

　　有研究表明[25],肥胖和细胞间的氧化应激有关,而氧化应激的产生是由活性氧(ROS)的增殖和清除失衡导致的。研究发现肥胖病人细胞内长链巯基辅酶A增加,它可抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转移体(adenine mononucleotide transport protein,AMTP)使ADP生成减少,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成增加,ROS可与线粒体内膜的不饱和脂肪酸作用生成脂质过氧化物丙二醛(MDA)等。过多的脂质过氧化物和ROS可消耗细胞内的抗氧化物,导致机体酶促及非酶促防御体系的抗氧化能力减弱[26]。而FFA中的不饱和脂肪酸是最容易受到活性氧(ROS)攻击的分子,它极易产生过氧化作用。其潜在的机制是,通过脂肪细胞中脂质的积累来激活NADPH氧化酶,诱导活性氧(ROS)的增加[27]。ROS在不饱和脂肪酸的不饱和键上不断地产生快速的过氧化作用,使MDA上升[28]。实验中高脂饮食组大鼠MDA升高,总抗氧化能力(TAOC)降低,也证明了肥胖与氧化应激存在密切关系;血清中FFA浓度的增加更是加重了肥胖大鼠的氧化应激反应。齐墩果酸组血清中MDA减少,TAOC升高,说明大鼠氧化应激反应减弱,机体抗氧化能力增加。有报道称[29]齐墩果酸可以提高抗氧化剂的水平;防止钙超载以减少自由基;可与葡萄糖及各种脂质来源的醛反应,其产物通过抑制磷脂过氧化反应而提高机体抗氧化能力。而实验中齐墩果酸组血清FFA的含量明显降低,甚至低于正常对照组,这可能也是齐墩果酸减少机体氧化应激反应的一个潜在机制。虽然有大量证据表明齐墩果酸具有较好地降低TG、TC、LDL,升高HDL的作用,但本实验中并未发现,这可能与用药时间有关。

　　综上所述,齐墩果酸可以抑制高脂饮食引起的大鼠体重增加,减少血清中FFA,提高机体的抗氧化能力,降低血清中LEP的水平,从多条途径改善高脂饮食引起的肥胖及代谢紊乱。

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