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【摘要】 目的 建立清利通胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对方中的栀子、萹蓄、大黄、川木通、甘草进行定性鉴别研究,用高效液相色谱(HPLC) 法测定方中主要有效成分栀子苷的含量。结果 薄层色谱鉴别分离度好,专属性强;含量测定平均回收率为99.3%,RSD为1.8%.结论 方法简便可靠,专属性强,重现性好,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 清利通胶囊;栀子苷;薄层色谱;高效液相色谱
【Abstract】 Objective To establish quality control standard of Qinglitong capsule.Methods Fructus Gardeniae,Herba Polygoni Avicularis,Radix et Rhizoma Rhei,Clematis armandi Franch and Radix Glycyrrhizae were identified by thinlayer chromatography (TLC). The content of geniposide which is the effective element in the preparation was determined as the index by high performance liquid chromatography (HPLC).Results The resolution and specificity of TLC was good. The recovery rate of content determination was 99.3%,and RSD was 1.8%.Conclusion The quality control is feasible and can be applied in mass production. The stability of the pharmaceutical quality can be ensured.
【Key words】 Qinglitong capsule; geniposide; thinlayer chromatography; high performance liquid chromatography
清利通胶囊是由栀子、车前子、瞿麦、萹蓄、滑石、大黄、川木通、灯心草、甘草九味药材组成的中药复方制剂。具有清热、利尿、通淋的功效,用于湿热下注,小便赤短,淋沥涩痛,口燥咽干。为有效地控制其内在质量[1],本研究对方中药材的薄层鉴别方法进行了系统研究,对其主要药味进行了薄层色谱鉴别,同时建立了高效液相色谱法测定方中主药栀子中主要有效成分栀子苷含量的方法,并制定了相应的含量测定限度。本研究最终建立了准确、可控的质量控制方法,从而为清利通胶囊质量标准的提高提供了依据。
1 仪器与试剂
仪器:岛津LC10Avp 高效液相色谱仪;色谱柱:DiamonsilTM 钻石C18 柱(150 mm×4.6mm,5 μm);Auto Science AS5150A 超声波清洗器;德国Sartorius 公司BP121S(万分之一)电子天平。
对照品:栀子苷对照品(批号:110749200511)、栀子对照药材(批号:120986200605)、槲皮素对照品(批号:100081200406)、大黄对照药材(批号:120902200408)、大黄酸对照品(批号:0757200206)、甘草次酸对照品(批号:110723200411)、齐墩果酸对照品(批号:7098903),均由中国药品生物制品检定所提供;试剂:甲醇为色谱纯(fisher 公司),水为重蒸馏水;硅胶G、硅胶H(青岛海洋化工厂);其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 栀子薄层色谱鉴别
取本品内容物2 g,加乙醚20 ml,研磨,滤过,弃去乙醚液,药渣挥干乙醚,加乙酸乙酯30 ml,加热回流1小时,放冷,滤液蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。另取栀子对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取阴性样品2 g,同法制成阴性样品溶液。再取栀子苷对照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验[2],吸取上述溶液各10 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10∶7∶2∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品和对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。阴性样品无干扰。
2.1.2 大黄薄层色谱鉴别
取本品4 g,加甲醇20 ml,浸渍1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 ml使溶解,加盐酸1 ml,加热回流30分钟,立即冷却,用乙醚振摇提取2次,每次20 ml,合并乙醚液,蒸干,残渣加氯仿1 ml溶解,作为供试品溶液。取大黄对照药材0.1 g,同法制成对照药材溶液。另取阴性样品4 g,同法制成阴性样品溶液。再取大黄酸对照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述溶液各10 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(14∶7∶1)为展开剂[3],展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品和对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;置氨蒸气中熏后,日光下检视,斑点变为红色。阴性样品无干扰。
2.1.3 甘草薄层色谱鉴别
取本品2 g,加水10 ml使溶解,加盐酸1.5 ml、三氯甲烷20 ml,加热回流1小时,放冷,分取三氯甲烷液,水洗涤后,加无水硫酸钠脱水,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。取阴性样品2 g,同法制成阴性样品溶液。另取甘草次酸对照品,加无水乙醇制成每1 ml含2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液15 μl,对照品溶液10 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5∶10∶4∶6)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。
2.1.4 川木通薄层色谱鉴别
取本品15 g,研细,加甲醇100 ml,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水25 ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次(50 ml,25 ml,25 ml),合并正丁醇液,用2%氢氧化钠溶液洗涤4次,每次25 ml,弃去碱液,再用正丁醇饱和水50 ml洗涤1次,分取正丁醇液,蒸干,残渣加乙醇25 ml使溶解,加盐酸2 ml,加热回流2小时,水浴浓缩至约5 ml,加水25 ml,用三氯甲烷振摇提取3次,每次25 ml,合并三氯甲烷液,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。取阴性样品15 g,同法制成阴性样品溶液。另取齐墩果酸对照品,加甲醇制成每1 ml含0.5 ml的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验,吸取对照品溶液5 μl,供试品溶液及阴性样品溶液各20 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环已烷-醋酸乙酯-氯仿-甲酸(20∶8∶5∶0.1)为展开剂[4],展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。阴性样品无干扰。
2.1.5 萹蓄薄层色谱鉴别
取本品3 g,研细,加甲醇40 ml,超声30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水20 ml使溶解,用乙醚振摇提取2次,每次20 ml,弃去乙醚液,水层用乙酸乙酯提取3次,每次20 ml,合并乙酸乙酯,蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。取阴性样品3 g,同法制成阴性样品溶液。另取槲皮素对照品,加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述溶液各10 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(5∶2∶1),展开,取出,晾干,置碘蒸气中熏后[5],日光下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Diamonsil C18(4.6×150 mm,5 μm),检测波长:240 nm,流动相:甲醇水(32∶78),流速:1.0 ml/min,柱温:30℃.理论板数按栀子苷峰计算应不低于2000.
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取栀子苷对照品适量,加甲醇制成每1 ml含栀子苷 21.5 μg的溶液,即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
取本品装量差异项下的内容物,研细,取约0.5 g,精密称定,置于50 ml量瓶中,加入50%甲醇20 ml,超声处理(功率150 W,频率50 kHz)30分钟,取出,放置至室温后,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液5 ml,置50 ml量瓶中,加甲醇至刻度,即得。
2.2.4 方法学的考察
专属性考察:取栀子阴性供试品,按供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。阴性样品色谱图见图1所示,图谱表明在该色谱条件下阴性对照无干扰。
线性范围的考察:精密称取栀子苷对照品10.75 mg,加甲醇制成每1 ml含栀子苷43.0 μg/ml的对照品溶液。精密量取1、2、3、4、5、7.5 ml栀子苷对照品溶液分别置于10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为线性考察的1～6号系列对照品溶液。各精密吸取10 μl进样,测定其峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标,进行回归,并计算回归方程。得标准曲线方程为:y=1 796 882.3 x-10 131.1,R=0.9998.由方程可知,进样量在0.0430～0.3225 μg之间,进样量和积分面积线性关系良好。
精密度试验:精密吸取栀子苷对照品溶液(21.5 mg/ml)10 μl,分别重复进样6次测定峰面积,计算相对标准差值,结果RSD为0.99,小于2%,表明仪器精密度良好。
稳定性试验:精密吸取同一样品溶液和对照品溶液,于0、2、4、8及12 h分别进样测定峰面积,计算相对标准差值,结果RSD分别为1.38和1.06,均小于2%,表明栀子苷及样品溶液在12 h内稳定性较好,能满足测定要求。
重现性试验:取同一批样品内容物0.5 g,6份,精密称定,分别按供试品溶液制备方法制备,测定栀子苷含量。结果RSD为1.6,小于2%,表明该方法重现性好。
加样回收率试验:精密称定已知栀子苷含量的样品(栀子苷含量为18.61 mg/g)0.5 g,6份,精密称定,分别精密加入一定量的栀子苷对照品,分别按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件进行测定,计算回收率,6 次试验的加样回收率测定结果均在95%～105%之间,其平均值为99.3%,RSD 为1.8%.具有较好的回收率,测定方法准确、可靠,符合含量测定的要求。结果见表1.表1 加样回收率试验结果
2.2.5 样品的含量测定
按前述含量测定方法测定3批样品中栀子苷的含量,考虑到药材的来源、炮制加工、制剂生产及贮存等因素,含量限度在3批均值的基础上下降20%,故暂定本品含量限度为5.8 mg/粒。结果见表2.3 讨论
薄层色谱鉴别川木通时,采用《中国药典》2005年及有关资料[6,7]展开剂试验所得主斑点Rf值较低,日光检视的斑点不清晰,采用本文展开剂条件,表2 样品含量测定结果图1 清利通胶囊高效液相色谱图(1为栀子苷的特征峰)A 对照品溶液 B 供试品溶液 C 阴性样品溶液
斑点较清晰,Rf值适中,分离效果好,但点样量较大,色带较重。该样品处理办法是参照《中国药典》2005年版一部川木通项下的方法进行处理,沈雪梅等[8]分析其原因可能为川木通药材中皂苷的含量太低或者样品在处理过程中齐墩果酸损失一部分。建议:改进川木通药材的提取方法,以改善齐墩果酸的鉴别效果,在此方面还有待进一步的研究,以获得更好的川木通薄层色谱鉴别方法。
栀子为方中主药,主要含栀子苷等环烯醚萜苷类成分[9]。用高效液相色谱法测定清利通胶囊中栀子苷的含量,方法简便、准确、重现性好,为本品的质量控制提供了分析方法。
流动相的选择:参照文献资料[10,11]及《中国药典》2005年版一部,考察流动相,选用了乙腈-水(15∶85)及不同比例的甲醇-水。以甲醇-水(32∶78)为流动相时保留时间适中,在该流动相条件下栀子对照品色谱峰峰形对称性较好,样品栀子苷色谱峰与杂质峰能达到基线分离。
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