西洋参茎叶皂苷对局灶性脑缺血后caspase9表达的影响

【摘要】  目的 研究西洋参茎叶皂苷(PQS)对大鼠局灶性脑缺血后caspase9表达的影响,并进一步探讨其机制。方法 采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCA),制备局灶性脑缺血模型,RTPCR技术检测大脑皮质凋亡相关基因caspase9 mRNA表达。结果 西洋参茎叶皂苷能明显降低局灶性脑缺血大鼠脑组织凋亡相关基因caspase9 mRNA表达。结论 西洋参茎叶皂苷对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用,其机理可能与西洋参茎叶皂苷抑制神经元细胞凋亡有关。

【关键词】  西洋参茎叶皂苷;脑缺血;细胞凋亡;caspase9

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects and the further mechanism of Panax quinquefolium saponins from stems and leaves (PQS) on caspase9. Methods The rats with incomplete cerebral ischemia were induced with line occlusion in the middle cerebral artery (MCA). Caspase9 mRNA in the cortical neuron was detected with reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Results Panax quinquefolium saponins significantly reduced the expression of caspase9 mRNA. Conclusion Panax quinquefolium saponins have protecting effect on cerebral ischemia,and the mechanism is related to inhibition of cell apoptosis.

　　【Key words】 Panax quinquefolium saponins from stems and leaves; cerebral ischemia; cell apoptosis; caspase9

　　脑血管病(CVD)是一种在世界范围内威胁人类健康的主要疾病之一,尤其是中、老年人具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高的特点,研究一种能有效防治缺血性脑血管病的药物具有重要的意义。西洋参茎叶皂苷(PQS)是从西洋参茎叶中提取的有效成分,具有多种药理作用,但对脑缺血细胞凋亡的研究较少,因此对PQS抗凋亡作用的研究,不仅能为综合利用开发西洋参资源,而且为研发抗脑缺血的新药奠定理论和实验依据。本研究利用RTPCR等技术手段,观察PQS对脑组织凋亡相关基因的影响，皆在从基因水平探讨PQS对局灶性脑缺血损伤的保护作用及其作用机制。

　　1 实验材料

　　1.1 试验药物

　　PQS(纯度>90%)由吉林大学基础医学院有机化学教研室提供;尼莫地平片(规格:20 mg):山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。

　　1.2 主要试剂

　　DNA Marker D2000,引物核苷酸片段,TRIquick Reagent,三羟甲基氨基甲烷(TRIS ),N马林代丙磺酸(MOPS),甲酰胺(FORMAMIDE),溴化乙锭(EB),乙二胺四乙酸(EDTA)等。

　　1.3 主要仪器

　　SWCJ2F型净化工作台(苏州净化设备有限公司),Z36HK型台式高速低温离心机(德国Hermle公司),MyCyclerPCR仪(美国BIORAD公司),Alpha Imager EC型凝胶成像分析系统(美国Alpha Inntech公司),DYY8C型电泳仪和DYCP31D型水平电泳槽(北京六一仪器厂)等。

　　1.4 实验动物

　　健康Wistar大鼠,体重300 g±20 g,雄性,鼠龄4～5个月,由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，动物合格证号:SYXK黑2008001.

　　2 实验方法与步骤

　　2.1 动物分组及给药

　　取50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,分别为PQS高、低剂量组、尼莫地平组、模型组、假手术组。PQS高剂量组100 mg/(kg·d)、低剂量组50 mg/(kg·d)、尼莫地平组21.6 mg/(kg·d)、模型组及假手术组给予同体积的生理盐水。各组均采取口服灌胃给药途径,每天给药一次,连续给药7天。最后一次给药30 min后,除假手术组外均参照longa法制备右侧大脑中动脉阻塞MCAO模型,在造模符合标准的动物中每组随机取出6只进行实验,假手术组动物仅行血管剥离术,术后随机取出6只进行实验。

　　2.2 RTRCR检测caspase9 mRNA的表达

　　2.2.1 引物设计

　　引物自行设计,以βactin为内参照,引物具体序列信息如下:(1)caspase9(Gene Bank NM_031632.1)引物序列:上游引物为5'-CTGCAGACACCAGCATCACT-3';下游引物为5'- AGGACCAGGCTCACTTAGCA-3';扩增产物片段长度327 bp.(2)内参照βactin(Gene Bank NM0311442)引物序列:上游引物为5'- TCTATGAGGGTTACGCGCTC-3';下游引物为5'- CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3';扩增产物片段长度452 bp.

　　2.2.2 取材

　　大鼠局灶性脑缺血后24 h,断头处死动物,取缺血侧大脑额顶叶皮质约100 mg,迅速将所取组织用锡纸包裹、编号,然后放进盛有液氮的保温瓶中进行快速冷冻,最后放入86℃超低温冰箱中保存备用。

　　2.2.3 总RNA提取

　　取出冻存的脑组织60 mg,置于研钵中,加入1 ml Trizol 充分研磨,抽提匀浆。将匀浆移入1.5 ml Eppendorf管,冰浴5 min.每管加入0.2 ml氯仿,剧烈震荡15 s,冰浴3～5 min.12 000 r/min、4℃,离心5 min,取水相移入1.5 ml新Ep管,加入等体积异丙醇(约为0.4 ml),混匀,冰浴放置10 min.12 000 r/min、4℃、离心10 min,弃去上清液,加入1 ml 75%乙醇(DEPC水配制),震荡拍匀。7 000 rpm、4℃,离心5 min,弃去上清液,超净工作台下倒置于干净滤纸上,自然干燥1～2 min,加入DEPC水30 μl混匀、溶解RNA,70℃保存。

　　2.2.4 RNA纯度与完整性鉴定

　　总RNA 的完整性和纯度要求:甲酰胺10 μl,37%甲醛3.5 μl,10 ×MOPS 2 μl,RNA样品液4.5 μl混匀,1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察样品28 s rRNA与18 s rRNA分离完整,且紫外分光光度计检测RNA样品A260/A280在1.8～2.0之间者为样品纯度合格。

　　2.2.5 RTPCR反应

　　按试剂盒程序操作配制RTPCR反应体系配制,然后移入PCR仪,按以下条件进行PCR反应:Caspsae9:①50℃ 30 min;②94℃ 2 min;③94℃ 30 s;④54℃ 30 s;⑤72℃ 30 s;⑥72℃ 7 min,其中③④⑤循环30 cycles.βactin:①50℃ 30 min;②94℃ 2 min;③94℃ 30 s;④56℃ 30 s;⑤72℃ 30 s;⑥72℃ 7 min,其中③④⑤循环30 cycles.

　　2.2.6 PCR扩增产物电泳及半定量分析

　　取3 μL目的基因PCR产物和3 μL对应βactin基因PCR产物,加2 μL上样缓冲液,在90 V电压下进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,时间为50 min.电泳完毕后,应用凝胶成像系统拍照,并用Imagepro Plus 6.0分析软件测定产物的累积光密度值(IOD),以目的基因产物IOD值与βactin产物IOD值之比表示目的基因mRNA的含量。

　　2.3 统计学方法

　　应用 SPSS17.0 统计分析软件进行统计学分析,实验结果以均数±标准差(±s)表示,单因素方差分析(OneWay,ANOVA)进行组间差异的比较,显著性差异水平以 0.05 和 0.01 为标准。

　　3 大鼠脑组织凋亡基因mRNA 表达产物分析

　　对大鼠脑皮质组织提取的RNA经RTPCR扩增后,分别于327、452 bp处出现了亮度不同的条带,说明各组均有Caspase9 mRNA的表达(见图1)。对各组条带进行吸光度分析(表1),可见模型组Caspase9 mRNA表达较假手术组明显增加,差异有显著性意义(P<0.01),PQS高剂量、低剂量组及尼莫地平组Caspase9 mRNA的表达较模型组明显减少,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。

　　4 讨论

　　细脑凋亡受基因编码调控，脑缺血后,凋亡相关基因及其表达产物发生了变化,导致细胞凋亡的发生。影响细胞凋亡的基因按其表达物对凋亡过程的作用大致可分为两类:一类为存活基因,主要包括Bcl2、BclxL、HSP、Cfos、sFas等,起抑制凋亡的作用;另一类为致死基因,主要包括caspases家族、Bax、Bad、NFkB、p53、Fas/Fasl等,起促进凋亡作用[1,2]，其中被研究较多的有Bcl2家族、caspase家族、P53等。表1 各组大脑皮质Caspase9 mRNA表达的比较图1 大脑皮质凋亡相关基因caspase9 RTPCR凝胶电泳图

　　目前发现脑缺血后神经元凋亡其信号转导通路有3条,即死亡受体通路、线粒体通路和caspase非依赖性途径,以前两条通路为主。死亡受体通路是指细胞表面的死亡受体[主要包括Fas/Apo1和肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)]通过其细胞外结构域与相应的死亡配体(FasL和TNFα)结合,将细胞外凋亡信号传入细胞内,激活caspase8 基因,而后激活下游的caspase3基因,最终启动细胞凋亡。线粒体途径是指当细胞受到各种因素的刺激(如缺血、缺氧等),线粒体膜去极化,线粒体膜电位下降,线粒体通透性转变孔开放,释放的凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf1)和细胞色素C(Cyt C)在dATP/ATP存在的情况下,形成凋亡体,激活caspase9,继而活化caspase3,引起细胞凋亡[3]，可见死亡受体通路和线粒体通路分别以caspase8 和caspase9 基因的激活为特征。有研究证实,脑缺血各亚组caspase8和caspase9 mRNA 及其蛋白质的表达水平均明显升高,而且其分布及动态演变规律与缺血后神经元凋亡的变化基本一致[4]。

　　本实验利用RTPCR法检测脑缺血后caspase9 mRNA的表达,发现模型组大鼠缺血侧脑组织caspase9 mRNA表达明显升高,PQS可抑制caspase9 mRNA的表达,与缺血后神经元凋亡的变化基本一致，提示线粒体通路参与了脑缺血后神经元凋亡的发生和发展。PQS能抑制细胞调亡而对脑缺血损伤产生保护作用,这可能是对脑缺血损伤保护作用的机制之一。

【参考文献】
  　[1] Shafer TJ,Atchison WD.Transmitter,ion channel and receptor properties of pheochromocytoma(PC12)cells:a model for neurotoxicological studies[J].Neurotoxicology,1991,12(3):473492.

　　[2] Yousuf S,Atif F,Ahmad M,et al.Selenium plays a modulatory role against cerebral ischemiainduced neuronal damage in rat hippocampus[J].Brain Res,2007,11(47):218225.

　　[3] 高欣,康立源,高秀梅.脑缺血后神经细胞凋亡通路及中药干预[J].中国中医药信息杂志,2007,4(7):9698.

　　[4] 张鸿,刘艳艳,贾春红,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注后caspase8 和caspase9 mRNA 及蛋白质表达[J].中国现代神经疾病杂志,2007,7(6):543547.