子宫内膜腺癌组织Ki67蛋白和caspase3表达及意义

【摘要】  目的 探讨增殖细胞核抗原（Ki67）蛋白及门冬氨酸特异的胱氨酸蛋白酶3（caspase3）在子宫内膜腺癌组织中的表达及其与临床病理参数间的关系，进而阐明它们在子宫内膜腺癌发生发展中的作用及其之间可能存在的关系。方法 应用免疫组化EnviSion法检测20例正常子宫内膜和70例子宫内膜腺癌组织中Ki67蛋白及caspase3的表达情况。结果 Ki67蛋白在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常子宫内膜组织（Hc=27.81，P<0.01）；caspase3在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率明显低于正常子宫内膜组织（uc=5.097，P<0.01）；Ki67蛋白表达与病人年龄及手术临床分期无关（Hc=3.590、5.888，P>0.05），而与病理分级、子宫肌层浸润深度及淋巴结转移有关（Hc=8.504、4.778，P<0.05；uc=2.963，P<0.01）；caspase3表达与病人年龄、手术临床分期、子宫肌层浸润深度及淋巴结转移均无关（Hc=4.371，uc=1.077～1.374，P均>0.05），而与病理分级有关（Hc=7.320，P<0.05）；子宫内膜腺癌组织Ki67的表达与caspase3呈负相关（rs=-0.241，P<0.01）。结论Ki67蛋白与子宫内膜腺癌侵袭和转移关系密切；Ki67蛋白和caspase3可能呈负反馈调节，共同参与子宫内膜腺癌的发生、发展以及细胞凋亡与增殖的病理过程。

【关键词】  蛋白质Ki67；门冬氨酸特异的胱氨酸蛋白酶3；子宫内膜肿瘤；免疫组织化学

    EXPRESSION OF Ki67 AND caspase3 IN  HUMAN ENDOMETRIAL ADENOCARCINOMA AND ITS SIGNIFICANCENIU  ZHAOSHAN， JI  XIANGRUI   (Laboratory of Micromorphology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of Ki67 protein and caspase3 in endometrial adenocarcinoma and its relationship with the parameter of clinical pathology and to interpret their role in the genesis and development of endometrial adenocarcinoma. MethodsThe expression of Ki67 protein in endometrial adenocarcinoma and caspase3 was detected by immunohistochemical EnviSion method in 20 cases of normal endometrium and 70 of endometrial adenocarcinoma. ResultsThe positive expression rate of Ki67 protein in endometrial adenocarcinoma was significantly higher than that in normal endometrium （Hc=27.81，P<0.01); the positive expression of caspase3 was markedly lower in endometrial adenocarcinoma than that in normal endometrium （Hc=27.81，P＜0.01）. There was no relationship between Ki67 protein expression and patient’s age and clinical stage （Hc=3.590,5.888;P>0.05 ）, but it was related to pathological grade, myometrial invasion and lymph node metastasis （Hc=8.504,4.778；uc=2.963;P<0.05,0.01). The expression of caspase3 did not correlate with  patient’s age, clinical stage, myometrial invasion, and lymph node metastasis, but it correlated with pathological grade （Hc=7.320，P<0.05）. Expression of Ki67 was correlated negatively with caspase3 （rs=-0.241，P＜0.01）. ConclusionThe expression of Ki67 is closely related to the infiltration and metastasis of endometrial adenocarcinoma, acting as a negative feedback regulation，Ki67 and caspase3 may be involved in common in the genesis and development of endometrial adenocarcinoma，and in the pathological process of cell apoptosis and proliferation.

    ［KEY WORDS］ protein Ki67； cysteinyl aspartatespecific proteinase3； endometrial neoplasms； immunohistochemistry

    子宫内膜癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，约占女性癌症的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%［1～4］。据统计，近年来子宫内膜癌的发病率有明显上升的趋势，已严重影响到妇女的生命健康。子宫内膜腺癌的发病机制复杂，与雌激素有直接的关系，并常涉及一系列复杂的基因事件。增殖细胞核抗原（Ki67）蛋白作为一种增殖细胞核抗原，可准确反映细胞增殖的情况，从而也可以反映出癌细胞的恶性行为。门冬氨酸特异的胱氨酸蛋白酶3（caspase3）是凋亡过程中主要的酶切效应因子［5］，对凋亡的完成起着至关重要的作用。本研究旨在通过免疫组化方法检测Ki67蛋白及caspase3在子宫内膜腺癌组织中的表达情况，探讨它们表达的临床意义及其相互关系，明确它们在子宫内膜腺癌发生、发展中的作用，为临床诊断、治疗该病提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    收集青岛大学医学院附属医院病理科1996年5月～2001年12月的子宫内膜癌手术标本70例，均为子宫内膜腺癌，按WHO标准进行子宫内膜腺癌病理组织学分级，G1级23例，G2级32例，G3级15例；按FIGO手术临床分期，Ⅰ期38例，Ⅱ期17例，Ⅲ期15例；≤1/2肌层浸润者30例，＞1/2肌层浸润者40例；无淋巴结转移者42例，有淋巴结转移者28例。70例病人中，年龄35～71岁，平均年龄55.8岁。另选择正常子宫内膜20例（其中分泌期组10例，月经期组10例）作为对照。所有标本均用40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋。病人手术前均未接受化学药物、放射治疗及性激素治疗。所有内膜组织均经病理学检查证实。

    1.2  检测方法

    免疫组化染色采用EnviSion法，Ki67鼠抗人单克隆抗体、Caspase3（JHM62）鼠抗人单克隆抗体及PV9000免疫组化试剂盒均购自北京中山生物试剂有限公司。阳性对照用已知阳性片；阴性对照省略一抗，以PBS代替。

    1.3  免疫组化染色结果判断

    细胞核染棕黄色为Ki67表达阳性。光镜下高倍视野分4区各计数200个细胞，共2个视野。Ki67染色阳性细胞＜10%为低表达(+)，10%～30%为中度表达()，＞30%为高表达()，未见着色为阴性(-)。caspase3阳性定性标准：caspase3抗原阳性反应于细胞质内和（或）细胞核内呈棕黄色颗粒。随机选择5～10个高倍视野，计算1 000个细胞中阳性染色细胞，结果评分参照文献［6、7］方法，其判断标准：阳性细胞数<5%为阴性（-）；6%～25%为弱阳性（+）；26%～50%为中度阳性（）；>50%为强阳性（）。

    1.4  统计学处理

    采用SPSS统计软件包进行统计学分析。等级资料采用秩和检验；相关性检验采用Spearman等级相关性分析。

    2  结    果

    2.1  Ki67蛋白及caspase3在正常子宫内膜及子宫内膜腺癌组织中的表达

    Ki67蛋白在子宫内膜腺癌组织中呈高表达，与正常子宫内膜组织比较差异有极显著意义（Hc=27.806，P<0.01）。caspase3在子宫内膜腺癌组织中的表达明显低于正常子宫内膜组织，两组比较差异有极显著性（uc=5.097，P<0.01）。见表1。

    2.2  Ki67蛋白及caspase3表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系

    Ki67蛋白表达与病人年龄及手术临床分期无关（Hc=3.590、5.888，P>0.05），而与病理分级、子宫肌层浸润深度及淋巴结转移有关（Hc=8.504、4.778，P<0.05；uc=2.963，P<0.01）；caspase3表达与年龄、手术临床分期、子宫肌层浸润深度及淋巴结转移无关（Hc=4.371，uc=1.077～1.374，P均>0.05），而与病理分级有关（Hc=7.320，P<0.05），其中G1级与G3级、G2级G3级比较，差异均有显著性（q=9.678、7.608，P<0.01），而G1级与G2级比较差异无显著性（q=1.692，P>0.05）。见表2。

    2.3  子宫内膜腺癌中caspase3与Ki67蛋白表达的关系

    子宫内膜腺癌组织中caspase3的表达强度与Ki67蛋白的表达强度呈负相关（rs=-0.241，P<0.05）。见表3。表1  Ki67蛋白及caspase3在子宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织中的表达表2  Ki67蛋白及caspase3表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系（

    3  讨    论

    3.1  Ki67在子宫内膜腺癌组织中表达的意义

    Ki67作为一种增殖细胞核抗原，与细胞有丝表3  子宫内膜腺癌组织中caspase3与Ki67蛋白表达的关系（分裂密切相关。它在G1后期开始出现，在S期和G2期逐渐升高，M期达到高峰，有丝分裂后迅速降解消失，半衰期仅为1 h或更短［8］，且不表达于DNA修复状态的细胞，因此较PCNA更能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性。许多研究表明，Ki67的表达与恶性肿瘤的组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、术后复发率和病死率等呈显著正相关［9～11］。本研究结果显示，在子宫内膜腺癌组织中Ki67蛋白的阳性表达，与正常内膜组织相比差异有显著性，说明正常内膜上皮细胞处于增殖活性较低状态，而癌细胞的增殖活性处于较高状态，提示Ki67蛋白可作为区分正常子宫内膜组织和恶性肿瘤组织的有效指标。同时，分化越低的肿瘤Ki67蛋白阳性表达率越高，表明在子宫内膜腺癌发生的过程中癌细胞生长失调，DNA合成紊乱，反映出癌细胞的恶性行为，说明Ki67蛋白能较准确地反映子宫内膜腺癌的增殖和分化情况。另外，本研究显示，随着肌层浸润深度及淋巴结转移的增加，Ki67蛋白阳性表达率呈上升趋势，且均具有显著性差异，提示增殖活性的改变与肿瘤的进展和侵袭转移过程有关。上述结果表明，Ki67蛋白的表达情况不仅能客观反映子宫内膜腺癌的增殖活性，并可能与癌细胞恶性进展、浸润性生长及发生转移的潜在危险性有关。

    3.2  caspase3在子宫内膜腺癌组织中表达的意义

    越来越多的资料表明，细胞凋亡与肿瘤的发生有密切关系。如果细胞凋亡受抑，细胞生存期延长，死亡率下降，正常应该凋亡的细胞继续存活，细胞数目增加，表现生长的优势，则有可能转化成肿瘤细胞。即细胞凋亡机制被不适当中止后，为细胞癌变提供了重要前提［12］。caspase是细胞凋亡中起关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其中caspase3是凋亡过程中主要的酶切效应因子［5］，对凋亡的完成起着至关重要的作用。caspase3被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞中，其可在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用激活成活化形式。激活的caspase3能使细胞结构、细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活，从而导致细胞凋亡［13］。由于caspase3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度。

    caspase3在不同肿瘤组织中表达及意义存在差异。SUN等［14］报道肝癌组织中的caspase3阳性表达率显著低于其癌旁组织，其表达与肝癌组织的分化有关，高分化者caspase3高表达。结直肠癌caspase3阳性表达率显著高于正常结肠黏膜，且其高表达与肿瘤复发相关［15］。对卵巢癌的研究则表明，caspase3在临床晚期、低分化、有淋巴结转移者的表达明显高于临床早期、高分化、无淋巴结转移者［7］。但对其他几种肿瘤的研究则显示，caspase3表达与肿瘤的临床分期、肿瘤复发和淋巴结转移无关［16，17］。目前对于caspase3在子宫内膜腺癌组织中的表达特点及临床意义尚不清楚。本研究从蛋白表达水平上初步检测了子宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织中caspase3的表达，结果表明，在正常子宫内膜组织中caspase3阳性表达强度多为中度阳性和强阳性，说明caspase3可能参与了正常子宫内膜的生理活动，对维持其正常功能非常重要。与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜腺癌组织的caspase3蛋白表达明显下调,两者之间有显著性差异，这可能与caspase3的丧失能抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的生长有关，提示caspase3表达下调参与了子宫内膜腺癌发生过程。由于caspase3是正常分化细胞所具有的成分，而肿瘤在转化过程中容易失去某些正常细胞所具有的表型。本研究显示caspase3在分化差的子宫内膜腺癌组织中表达明显下降，说明是肿瘤异常分化所致，caspase3参与了子宫内膜腺癌凋亡和增殖的失衡过程。并提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻；反之亦然。

    3.3  Ki67蛋白和caspase3在子宫内膜腺癌组织中表达的相互关系

    细胞增殖与凋亡之间的动态平衡的失调与多种肿瘤的发生、发展密切相关，但目前尚不能完全阐明其中许多机制。Ki67蛋白和caspase3分别是体现细胞增殖和凋亡的良好指标，虽然在肿瘤的发生机制中Ki67蛋白的过表达和caspase3的表达下调在许多研究结果中相同。但两者之间是否相关以及是正相关还是负相关，目前国内尚未见相关报道，即使国外也仅有少量研究。HOSHI等［18］对胃腺癌中caspase3和Ki67蛋白的相关表达的研究提示，在胃腺癌中caspase3表达受阻和Ki67蛋白过度表达呈较弱的负相关， 虽然没有达到统计学意义，但为研究两者之间的关系提供了线索。

    本研究结果显示，Ki67蛋白阳性表达强度和caspase3表达强度呈显著的负相关，这可能是由于caspase3表达下调导致肿瘤细胞凋亡受阻，而引起了细胞异常活跃增殖、Ki67过表达的现象。本研究结果提示两者可能呈负反馈调节，共同参与子宫内膜腺癌的发生、发展以及细胞凋亡与增殖的病理过程。但其具体机制尚待进一步深入研究探索。

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作者单位：（青岛大学医学院，山东 青岛 266071； 1 人体显微结构学实验室; 2 病理学教研室）