细胞凋亡和Caspase3在梗阻性肾组织中表达及其意义

　　Significance of apoptosis and Caspase3 expression in chronic obstructive kidneys

　　Xie Qingxiang, Lin Xiacong, Han Congxiang

　　(Department of Urology, the 175th Hospital of PLA, Zhangzhou 363000, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the roles and mechanisms of apoptosis and its effector molecule Caspase3 in the pathogenesis of chronic obstructive kidney. Methods  Caspase3 expressions in 43 obstructive renal tissues and 10 normal renal tissues were examined by immunohistochemistry, and apoptosis was examined by TUNEL methods. The relationships between Caspase3 expression of obstructive renal tissues and degree of hydronephrosis and renal fibrosis were evaluated. Results  Both Caspase3 expressions and apoptosis indexes in tubular and interstitial cells of obstructive kidneys were significantly higher than those in normal kidneys (P<0.05). Caspase3 expressions in obstructive kidneys were in close association with apoptosis and hydronephrosis (P<0.05). Caspase3 expressions in interstitial cells of obstructive kidneys were closely related to the degree of renal fibrosis (P<0.05). Conclusion  Increased Caspase3 activity plays an important role in renal cell apoptosis associated with urinary obstruction.

　　KEY WORDS: kidney tissue; hydronephrosis; apoptosis; Caspase

　　摘要：目的  探讨细胞凋亡及其效应分子Caspase3在梗阻性肾病中的作用及其机制。方法  应用免疫组化方法和原位细胞凋亡检测法分别检测43例梗阻肾组织和10例正常肾组织中Caspase3表达和细胞凋亡指数，并分析梗阻肾Caspase3表达与肾积水程度及肾纤维化程度之间关系。结果  梗阻肾的肾小管和间质中细胞凋亡指数和Caspase3表达均显著高于正常肾组织(P<0.05)，而且Caspase3表达与细胞凋亡指数密切正相关(P<0.01)，与肾积水程度也密切正相关(P<0.05)；梗阻肾间质Caspase3表达与肾纤维化程度密切相关(P<0.05)。结论  Caspase3活性增强导致细胞凋亡增多在梗阻肾病理生理过程中起着重要作用。

　　关键词：肾组织；肾积水；细胞凋亡；Caspase
　
　　由各种原因引起的尿路梗阻而导致的肾积水是泌尿外科常见病，但对于其肾萎缩、肾纤维化分子病理过程了解甚少。本研究通过检测梗阻性肾组织中细胞凋亡及其主要效应分子Caspase3的表达，探讨两者在梗阻性肾病的病理生理过程中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料  收集本院1991年1月至2002年12月因梗阻性肾积水行患肾切除43例患者，年龄6-73岁，平均37岁；男27例，女16例。梗阻原因：肾盂输尿管交界处狭窄11例，输尿管末段狭窄3例，输尿管全程炎性狭窄1例，肾结石13例，输尿管上段结石9例，中段2例，下段1例，肾盂癌3例。静脉肾盂造影检查41例：不显影(2h以内)36例，延迟显影5例。根据肾皮质厚度(大部分)将肾积水程度分为两级：皮质厚度≤3mm 29例，3-7mm 14例。肾盂尿检查30例：pH值7.0-8.1，尿比重均≤1.01。取患肾明显薄软处组织和10例正常肾组织进行石蜡包埋，切片。常规HE染色，病理组织学检查。

　　1.2  方法  ①免疫组化：采用SABC方法(微波炉热修复)。Caspase3(1∶40)为兔抗人多克隆抗体，SABC试剂盒为武汉博士德生物公司提供。DAB显色，苏木素复染。PBS替代一抗作为阴性对照。②细胞凋亡检测：采用原位细胞凋亡TUNEL检测法，按说明书进行操作(德国宝灵曼公司提供)。③肾组织中胶原纤维染色：采用Van Gieson苦味酸酸性复红染色法行胶原纤维染色，显微镜下观察，胶原纤维呈红色，肌纤维等组织呈黄色。

　　1.3  结果判断  Caspase3阳性染色主要分布于细胞浆中，少数也见于细胞核，呈棕黄色或棕褐色。按阳性细胞数分为三个等级，阳性细胞数0为阴性(-)、≤25%为弱阳性(+)、＞25%为强阳性()。凋亡指数：至少计数500个细胞中凋亡阳性细胞百分比。根据胶原纤维含量判断肾纤维化程度：0级(正常)为肾小球囊周和肾小管基底膜无胶原纤维染色，一级为肾小球和肾小管，周围可见胶原纤维染色，二级为肾小球和肾小管，周围胶原纤维染色明显增强、肾小管基底膜增厚，三级为肾间质，可见明显的胶原纤维染色。

　　1.4  统计方法  应用SPSS 10.0统计软件包，采用χ2检验、方差分析和两样本比较t检验。

　　2  结    果

　　由表1可见，Caspase3在肾小管和肾间质中均可见阳性表达，梗阻肾组织的肾小管和间质中Caspase3表达均分别高于正常肾组织(P<0.05)。肾小管中Caspase3表达与肾纤维化之间相关无显著性(P>0.05)，但间质中Caspase3表达随肾纤维化程度加重而增高(P<0.05) 。肾皮质厚度≤3mm的肾小管Caspase3表达显著高于皮质厚度3-7mm者(P<0.05)；但两者间质中Caspase3表达无统计学差异(P>0.05)。梗阻肾的肾小管和间质中细胞凋亡指数均分别高于正常肾组织(P<0.01)；梗阻肾中，随着肾纤维化和肾积水程度加重，细胞凋亡指数也相应增多(P<0.01，表1)。梗阻肾的肾小管中Caspase3阳性表达者的细胞凋亡指数为8.3±3.6，显著高于阴性表达者的4.6±2.1，P<0.01；梗阻肾的间质中Caspase3阳性表达者细胞凋亡指数为7.5±3.1，显著高于阴性表达者的4.8±2.0，P<0.01。

　　表1  Caspase3和细胞凋亡在梗阻及正常肾组织中表达与肾纤维化之间关系　略

　　3  讨    论

　　目前对于梗阻性肾病的分子水平上发病机制了解较少，尤其是国内少有研究报道。一些学者研究显示细胞凋亡参与输尿管梗阻后的肾病理生理过程，但多为动物实验且观察的时间较短\[13\]，对于细胞凋亡与临床上梗阻性肾病之间关系尚未见报道。多位学者通过动物实验研究表明输尿管梗阻后肾小管和间质中细胞凋亡均增加，但肾小管的细胞凋亡变化过程并不一致\[13\]。本组结果也显示临床上慢性梗阻性肾组织的肾小管和间质中细胞凋亡均高于正常对照组，随着肾纤维化和肾积水程度加重、肾小管和间质中细胞凋亡指数也上升，提示细胞凋亡在梗阻性肾病的病理生理过程中起着重要作用，肾间质和肾小管中细胞凋亡增加是肾萎缩发生的主要原因。本组结果显示随着肾纤维化程度加重、肾间质和肾小管细胞凋亡并没有减少，相反呈上升趋势，推测在梗阻肾纤维化过程中，促进纤维细胞增殖的因子所发挥作用比诱导细胞凋亡的因子更为重要。至于临床上慢性梗阻性肾小管细胞凋亡并没有随时间延长而减少，这与动物实验结果不尽相同\[13\]，可能与临床上患者梗阻程度及时间比动物实验更为复杂且存在种类差异有关。Caspase3家族是细胞凋亡下游关键酶，而且诱导细胞凋亡实质上都是通过Caspase蛋白的次序激活而实现的，而Caspase3是该家族最重要成员，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase3介导的信号传导途径导致细胞凋亡\[4\]。动物实验表明多数Caspase家族成员在慢性梗阻性肾组织中活性及表达均增强，且在梗阻肾的细胞凋亡调控机制中起着重要作用，其中Caspase3活性随梗阻时间延长，活性及表达均增强，而且与细胞凋亡密切相关\[3\]。本组结果也显示梗阻肾组织中的肾小管和间质均见Caspase3分布，其表达均较正常肾组织增强，且与各自的细胞凋亡指数之间密切相关，提示Caspase3活性增强参与梗阻肾的病理生理过程，是梗阻肾细胞凋亡重要调控因子。本组结果显示梗阻肾组织Caspase3表达随肾积水程度加重而增强，尤其是肾小管中表现更为明显，提示梗阻肾Caspase3表达增强是肾损伤、肾小管萎缩乃至肾萎缩的重要原因之一。实验研究显示Caspase3抑制剂能够抑制肾缺血灌注过程中肾细胞凋亡和减轻肾组织炎症及损伤\[5\]，这为梗阻性肾病在梗阻尚未解除时如何减轻或延缓肾功能损害、梗阻解除后如何尽快促进肾功能恢复提供新的防治方向。不同原因导致的肾纤维化是一个涉及多因子调控失衡复杂过程，以往多重视细胞因子对细胞外基质合成与降解、肌成纤维细胞的聚集等的调控作用的研究，对于细胞凋亡及其调控因子的作用了解较少。Yang等\[6\]研究表明Caspase3在鼠肾大部分切除后的残余肾硬化过程中起重要作用，其表达水平与残余肾细胞凋亡、炎症和纤维化之间密切相关。本组结果显示，随着梗阻肾纤维化的加重、肾间质中Caspase3表达水平也上调，但肾小管中Caspase3表达水平与肾纤维化程度并不一致，这可能与肾间质在肾纤维化过程中作用更为重要有关，上述结果表明肾间质Caspase3的表达水平升高对梗阻肾纤维化过程影响的重要性。本组也观察到在肾梗阻程度较轻者，其间质中炎症细胞Caspase3呈较高表达，而在肾梗阻程度较重者，其间质中炎症细胞Caspase3表达减弱、甚至阴性表达，推测在肾梗阻发生后早期，机体通过调节Caspase3表达以促使炎症细胞凋亡、减轻炎症细胞分泌的细胞因子对肾的损伤，在肾梗阻后期，由于炎症细胞Caspase3表达减少，从而细胞凋亡减少，使其分泌的细胞因子增多，促使肾细胞外间质等合成增多，以至加快肾纤维化过程，这可能是Caspase3参与梗阻肾纤维化过程的机制之一。

　　参考文献：

　　\[1\]Choi YJ, BaranowskaDaca E, Nguyen V, et al. Mechanism of chronic obstructive uropathy: increased expression of apoptosispromoting molecules \[J\]. Kidney Int, 2000, 58:14811491.

　　\[2\]Liapis H, Yu H, Steinhardt GF. Cell proliferation, apoptosis, bcl2 and bax expression in obstructed opossum early metanephroi \[J\]. J Urol, 2000,164(2):511517.

　　\[3\]Truong LD, ChoiYJ, Tsao CC, et al. Renal cell apoptosis in chronic obstructive uropathy: the roles of caspases \[J\]. Kidney Int, 2001,60(3):924934.

　　\[4\]Woo M, Hakem R, Soengas MS, et al. Essential contribution of caspase 3/CPP32 to apoptosis and its associated nuclear changes \[J\]. Genes Dev, 1998,12(6):806819.

　　\[5\]Kaushal GP, Singh AB, Shah SV. Identification of gene family of caspases in rat kidney and altered expression in ischemiareperfusion injury \[J\]. Am J Physiol, 1998, 274(3pt 2):587595.

　　\[6\]Yang B, Nahas ME, Thomas GL, et al. Caspase3 and apoptosis in experimental chronic renal scarring \[J\]. Kidney Int, 2001,60(6):17651776.

　　作者简介：谢庆祥(1967)，男(汉族)，硕士，副主任医师，硕士生导师. 研究方向：泌尿外科基础与临床. Email: xieqx@sohu.com   
　　解放军第175医院泌尿外科，福建漳州  363000

　　(编辑  胡爱玲)