Literature
首页医源资料库在线期刊齐鲁医学杂志2008年第23卷第3期

刺参黏多糖对人宫颈癌Hela细胞caspase表达影响

来源:《齐鲁医学杂志》
摘要:【摘要】目的探讨刺参黏多糖对人宫颈癌Hela细胞株体外生长、凋亡的影响及可能机制。0g/L刺参黏多糖分别处理Hela细胞24~120h后,以四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定细胞生长活性,透射电镜观察细胞形态,RTPCR法检测凋亡相关基因caspase3、caspase9mRNA的表达。结果刺参黏多糖对Hela细胞的生长具有抑......

点击显示 收起

【摘要】  目的 探讨刺参黏多糖对人宫颈癌Hela细胞株体外生长、凋亡的影响及可能机制。方法 以0~8.0 g/L刺参黏多糖分别处理Hela细胞24~120 h后,以四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定细胞生长活性,透射电镜观察细胞形态,RTPCR法检测凋亡相关基因caspase3、caspase9 mRNA的表达。结果 刺参黏多糖对Hela细胞的生长具有抑制作用,电镜下可观察到凋亡小体等细胞凋亡的形态学改变。随着药物浓度及作用时间的增加,caspase3及casepase9 mRNA表达增加。结论 刺参黏多糖可抑制Hela细胞生长,诱导Hela细胞的凋亡,其机制可能是通过诱导caspase3及caspase9 mRNA表达增多实现的。

【关键词】  刺参科 宫颈肿瘤 Hela细胞 凋亡 caspase

  EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS SEKENKA ON CASPASE EXPRESSION OF HELA CELLS OF CERVIX NEOPLASMS

  WANG YING, YU ZHUANG, SONG YANG

  Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

  [ABSTRACT] Objective To study the apoptosis of Hela cells of cervix neoplasms induced by stichopus japonicus sekenka (SJAMP) and its possible mechanism. Methods Hela cells were treated with different doses of SJAMP on different time. The inhibitory effect on cell proliferation was assayed by MTT, the apoptosis observed by electronic microscopy. The expression of caspase3 and caspase9 was assayed with reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results SJAMP suppressed the growth of Hela cells obviously in doseand timedependent manners. Morphological changes of cell apoptosis, such as karyopyknosis and conglomeratio, were observed electronic microscopically.  RTPCR assay showed the expression of caspase3 and caspase9 increased after exposure to different doses of SJAMP on different time. Conclusion SJAMP can inhibit proliferation and induce apoptosis of Hela cells, caspase3 and caspase9 may have an important rule in the regulation of cell apoptosis.

    [KEY WORDS] Stichipodidae; Cervix neoplasms; Hela cells; Apoptosis; Caspase

    刺参黏多糖(SJAMP)为海洋腔肠类动物刺参体内提取的一种天然海洋活性物质,属多糖类物质。初步研究证实,SJAMP具有广谱的抗肿瘤活性,能抑制多种恶性肿瘤细胞增殖,但有关其与凋亡的关系的研究则少见报道。本研究以SJAMP作用于人宫颈癌Hela细胞,观察其诱导凋亡的作用,并进一步探讨其可能机制。

  1  材料和方法

  1.1  实验材料

    SJAMP,由中国海洋大学药物研究所提供,相对分子质量 122 248,纯度 99.5%; DMEM、胰蛋白酶, GIBCO公司产品;胎牛血清,杭州四季青公司产品;TRIzol试剂,GIBCO公司产品;反转录试剂盒,Promega公司产品;TaqDNA聚合酶,上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司产品。BNP310恒温CO2培养箱,日本TABAI ESOEC公司;PCR仪,Biometra公司;ViDAS21图像分析系统,德国欧波同公司;天能凝胶图像分析系统,上海天能科技公司;流式细胞仪,美国BD公司。

  1.2  方法

  1.2.1  细胞培养 

  人宫颈癌Hela细胞为本实验室传代保存,培养于含体积分数0.05的CO2、37 ℃湿化孵箱中。培养基DMEM含体积分数0.10的FBS,取对数生长期细胞待用。

  1.2.2  MTT法检测SJAMP对Hela细胞增殖的影响 

  调整细胞浓度为 1×107 /L,将200 μL细胞接种于96孔板,置于培养箱中培养24 h;分组加药,以未加药组为对照组,调整药物浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L(各组取6个复孔),培养72 h,每孔加入20 μL MTT液(5 g/L),培养箱中培养4 h后吸取上清,加入150 μL DMSO,振荡10 min,测波长570 nm 处吸光度(A) 值,计算SJAMP对Hela细胞的抑制率。抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值) /  对照组A值×100%。

  1.2.3  细胞形态学观察 

  选择对数生长期的Hela细胞,常规消化后,置37 ℃,含体积分数0.05 CO2 湿化培养箱内孵育6 h,随机分为空白对照组和给药组,给药组分别加入0.8、1.2、1.6 g/L SJAMP,对照组加入等量的培养液,分别于给药后24、72和120 h在倒置显微镜下观察各组Hela细胞的形态改变。细胞常规消化离心后,经固定、脱水、包埋、固化、染色、切片等处理,透射电镜(JEOL公司JEM1200EX)观察。

  1.2.4  凋亡相关基因caspase3、caspase9表达检测 

  采用RTPCR法。以βactin作为内参照,目的基因片段为caspase3和 caspase9。内参引物均由DNAStar软件设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成。见表1。表1  目的基因及其内参引物基因上游引物 (略)
  
    以对照组(不加药)及3种药物浓度(0.8、1.2、
 1.6 g/L)处理后24、72、120 h的Hela细胞为样本,按照TRIzol试剂说明书分别提取RNA。RTPCR反应条件:混匀后42 ℃ 1 h,99 ℃加热5 min,然后快速冷却到4 ℃。反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板,-20 ℃保存备用。PCR扩增反应体系及条件:①caspase3: 94 ℃ 5 min预变性; 94 ℃45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。②caspase9: 94 ℃ 5 min预变性; 94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。扩增产物经12 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 紫外线透射仪中观察,拍照,并输入天能凝胶图像分析系统进行分析。以目的PCR产物的吸光度(A)与内参照PCR产物吸光度(A)的比值,作为半定量RTPCR结果。

  1.3  统计学处理

    数据处理采用SPSS 11.0统计学分析软件,结果以±s表示,两组间比较用t检验,多组间数据比较用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

  2  结 果

  2.1  细胞形态学

    光镜下观察:对照组Hela细胞为多角形或梭形,贴壁牢固。经SJAMP处理的实验组细胞逐渐变圆,细胞体积缩小,胞浆凝缩,折光率增强,细胞膜完整但出现发泡现象,随着时间的延长悬浮细胞逐渐增多,出现细胞凋亡的特征性改变。

    电镜下观察:在细胞凋亡的早期发生核内染色质聚集成块,位于核膜下,形成“新月形”改变,到中期时细胞膜皱缩,形成小泡或突起,核膜破裂,块状染色质散布于细胞中,细胞体积变小,细胞形成许多由细胞膜包裹呈块样染色质的小体,内含正常的细胞器,即凋亡小体。

  2.2  SJAMP对Hela细胞增殖的影响

    与对照组比较,各浓度SJAMP组A值均降低,随着浓度的增高,A值降低愈明显,差异有显著性(F=658.20,q=3.06~45.32,P<0.05、0.01)。随着SJAMP剂量的加大,细胞数量减少,A值相应减小(q=3.91~42.27,P<0.01),抑制率增大,呈明显的剂量依赖关系,至8.0 g/L时细胞基本上全部被杀死。见表2。表2  不同浓度SJAMP作用下细胞吸光度(A)值及抑制率比较组别      A值(±s)抑制率(略)

  2.3  SJAMP作用下Hela细胞caspase3及caspae9的表达

    随SJAMP浓度的增大及作用时间的延长,Hela细胞中caspase3及caspase9的表达均有增加趋势(图2~5)。

  3  讨 论

    细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程,它的发生受
到机体的严密调控。许多抗癌药物都是通过触发肿瘤细胞凋亡通路而达到抑制肿瘤生长的目的,因此,以药物诱导肿瘤细胞凋亡也被用于新的抗肿瘤药物的筛选。

    SJAMP具有广谱的抗肿瘤活性,能抑制多种恶性肿瘤细胞增殖,诱发细胞凋亡,但其抗肿瘤的分子机制还处于研究阶段[1]。樊绘曾等[2]实验表明,小鼠经腹腔或静脉注射海参提取物对转移性肿瘤有显著的抑制作用,特别是对MA737乳癌抑制率可达88%,对小鼠淋巴内瘤S180抑制率为55%~61%,对小鼠淋巴内瘤Lio21 和S37 的抑制率达66%,并可抑制肺癌转移和肿瘤细胞生长。王振立等[3]通过3H2TdR 掺入试验研究显示,SJAMP可明显抑制S180 及鼠乳腺肿瘤细胞DNA 的合成,从而抑制肿瘤生长,而对荷瘤小鼠正常肝细胞的DNA 合成则能明显促进,这有利于正常肝细胞的增殖。胡人杰等[4,5]研究了SJAMP与泼尼松联合应用对小鼠实体瘤的抑制作用,结果表明,SJAMP不仅可以恢复泼尼松所致的免疫抑制,而且对小鼠实体瘤、肺癌及胃纤维肉瘤均有较好的抑制作用,抑瘤率为27%~82%。

    细胞形态学的变化是判断凋亡发生最可靠的标准[6]。细胞在发生凋亡过程中有着典型的形态学特征。本实验以不同剂量SJAMP作用于Hela细胞,观察到了典型的凋亡细胞的形态学改变:在细胞凋亡的早期发生核内染色质聚集成块,位于核膜下,形成“新月形”改变;到中期细胞膜皱缩,形成小泡或突起,核膜破裂,块状染色质散布于细胞中,细胞体积变小,细胞形成许多由细胞膜包裹呈块样染色质的小体,内含正常的细胞器,即凋亡小体。上述变化提示SJAMP可诱导细胞凋亡。

    细胞凋亡可由外源性途径(死亡受体途径)和内源性途径(线粒体细胞色素C 途径)所介导。外源性途径由死亡诱导配体与细胞表面受体结合后激活。死亡受体包括FAS、TNFR、TRAILR等, 受体与配体结合后发生寡聚化, 募集接头蛋白FADD和caspase8形成DISC,caspase8自身切割活化, 进一步激活下游的caspase(包括caspase3、caspase6、caspase7),启动细胞凋亡。内源性途径由包括通过理化因素导致细胞的DNA损伤、生长因子缺乏、氧化应激等刺激信号激活。内源性刺激导致细胞色素C从线粒体释放入胞浆,与凋亡酶激活因子1和caspase9 结合形成凋亡体, caspase9 自我剪切活化, 启动caspase级联反应[7~11]。本实验对凋亡的执行者caspase3 以及其上游的主要激活因子caspase9 mRNA的表达进行检测, 结果显示,经药物处理组Hela 细胞的caspase3和caspase9基因表达上调,提示这些凋亡通路关键酶的激活可能是SJAMP诱导Hela细胞凋亡的重要原因。并进一步推测SJAMP诱导Hela 细胞凋亡和线粒体细胞色素C途径参与有关。

    综上所述,本实验从细胞形态学、细胞生长受抑制情况和caspase3、caspase9表达等方面证实,一定浓度的SJAMP在体外能够诱导人宫颈癌细胞株Hela发生凋亡,并初步提示SJAMP诱导Hela 细胞凋亡和线粒体细胞色素C途径参与有关。本文结果为SJAMP应用于临床肿瘤治疗提供了有价值的实验依据, SJAMP有望成为具有良好应用前景的抗癌药物。

 

【参考文献】
    [1]李华荣. 抗肿瘤海洋药物研究进展[J]. 医药导报, 2004(10):756757.

  [2]樊绘曾,陈菊挥,林克忠. 刺参酸性黏多糖的分离及其理化性质[J]. 药学学报, 1980(15):263.

  [3]王振立,刘桂敏,郑瑞,等. 刺参酸性黏多糖抑制小鼠肿瘤细胞DNA合成及其代谢研究[J]. 中国医药工业杂志, 1993,24 (9):405408.

  [4]胡人杰,于苏萍,姜卉,等. 刺参酸性黏多糖与可的松联用方案对小鼠肿瘤的抑制作用[J]. 癌症, 1997,16(6):422424.

  [5]丁守怡,杨英. 螺旋藻多糖对人宫颈癌Hela细胞体外生长的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2002,38(4):346347.

  [6]KUNG A L, ZETTERBERG A, SHERWOOD S W, et al. Cytotoxic effects of cell cycle phase specific agent: result of cell cycle perturbation[J]. Cancer Res, 1990,50(22):7307.

  [7]GREEN D R, REED J C. Mitochondria and apoptosis[J]. Science, 1998,281(5381):13091312.

  [8]KONOPLEVA I, ZHAO S, XIE Z, et al. Apoptosis: molecules and mechanisms[J]. Adv Exp Med Biol, 1999,457:217236.

  [9]ZHAN Y, WATER B, WANG Y, et al. The roles of caspase3 and bcl2 in chem icallyinduced apoptosis but no t necrosis of renal peithelial cells[J]. Oncogene, 1999,18(47):6505.

  [10]CAIN K, BRATTON S B, LANGLAI S C, et al. Apaf1 oligomerizes into biologically active -700kDa and inactive-1.4MDa apoptosome complexes[J]. J Biol Chem, 2000,275(5):60676070.

  [11]刘希双,候仁好. Bcl2与Caspase3蛋白在胃癌中的表达及其意义[J]. 青岛大学医学院院报, 2005,41(3):232234.


作者单位:青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东 青岛 266003

作者: 王颖
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具