人生长激素对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

【摘要】  目的 探讨人生长激素在体内对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 建立裸鼠胰腺癌移植瘤皮下模型,分为对照组、顺铂(DDP)组、重组人生长激素(rhGH)组和DDP+rhGH组,通过流式细胞仪、免疫组化和TUNEL法检测移植瘤的细胞周期、核增殖抗原、凋亡细胞。结果 DDP组和DDP+rhGH组比对照组或rhGH组S期细胞、核增殖抗原明显降低(P<0.05),凋亡指数明显升高(P<0.05);而rhGH组与对照组各项指标比较无明显差异(P>0.05)。结论 外源性人生长激素在体内对人胰腺癌细胞的增殖和凋亡无明显作用。

【关键词】  人生长激素;胰腺癌;细胞周期;核增殖抗原;凋亡

　【Abstract】 Objective To study the effects of human growth hormone on proliferation and apoptosis of human pancreatic carcinoma cells of human in vivo. Methods Nude mice were randomly divided into control group,cisplatin (DDP) group,recombinant human growth hormone (rhGH) group and DDP+rhGH group after human gastric cancer xenograft model of nude mice was successfully established. The cell cycle,caryon proliferation antigen (PCNA),apoptosis index (AI)of xenograft were investigated by flow cytometry,immunohistochemistry,and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphate biotin nick end labeling (TUNEL) respctively. Results Cells in S phase,PCNA of gastric cancer xenograft obviously degraded,but AI obviously increased in DDP group and DDP+rhGH groups compared with control and rhGH groups (P<0.05). Between rhGH group and control group,there was no difference in above indices. Conclusion Exogenous human growth hormone has no obvious effects on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cells in vivo.

　　【Key words】 human growth hormone; pancreatic cancer; cell cycle; caryon proliferation antigen; apoptosis

　　目前已认为重组人生长激素(rhGH)能显著改善晚期恶性肿瘤患者的营养状况，但由于rhGH是否能促进肿瘤的增殖与分裂还存在争议[1,2],所以临床上能否应用rhGH对恶性肿瘤患者进行代谢调理治疗存在顾虑。本研究通过对荷人胰腺癌裸鼠短期应用rhGH后,分析移植瘤的细胞周期、核增殖抗原、凋亡细胞,从而探讨rhGH对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响,为临床胰腺癌患者应用rhGH进行代谢调理治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　Nunu裸鼠,6周龄,体重13～22 g,雌性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,在昆明医学院天然药物药理重点实验室SPF级条件下饲养;人高转移胰腺癌细胞株ASPC1(中科院上海细胞生物所细胞库),rhGH(安徽安科生物工程股份有限公司),顺铂(DDP)(云南个旧生物药业有限公司),流式细胞仪(COULTER公司),TUNEL试剂盒、核增殖抗原免疫组化试剂(PCNA)(福建迈新试剂公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 裸鼠胰腺癌移植瘤模型制作

　　将人胰腺癌细胞ASPC1常规细胞培养,配置为密度为2×107/ml的细胞悬液,以每只0.2 ml接种于2只裸鼠的右臀部皮下。测量瘤体长短径,待裸鼠胃癌移植瘤生长至长径约1.0 cm左右,处死裸鼠,取出移植瘤,把瘤体切取成2 mm×2 mm×2 mm的包块,并将包块接种于裸鼠臀部,裸鼠胃癌移植瘤模型建立。

　　1.2.2 实验分组及给药方法

　　接种后21天,选取瘤体生长良好的裸鼠随机分成4组:对照组、DDP组、rhGH组和DDP+rhGH组,每组6只裸鼠。于实验分组后当日给药,对照组皮下注射与rhGH组等体积的生理盐水0.2 ml,DDP组按2 mg/kg腹腔注射DDP溶液,rhGH组按2.5 IU/kg皮下注射rhGH溶液,DDP+rhGH组同DDP组和rhGH组,每天1次,连续给药6天。

　　1.2.3 指标检测

　　给药结束后取部分移植瘤,制成单细胞悬液,离心2 000 r·min-1,5 min后弃上清液加入碘化丙啶荧光素染色,将等体积的细胞悬液和碘化丙啶染液混合,4℃放置20～30分钟,测定前用300目尼龙膜过滤,将样品放入流式细胞仪样品室激发波长488 nm,用流式细胞仪进行细胞周期检测。另取裸鼠部分移植瘤,甲醛固定,石蜡包埋,免疫组法检测移植瘤核增殖抗原(PCNA),TUNEL法检测凋亡细胞,计算凋亡指数(AI)。光学显微镜观察计数5个以上不少于1000个细胞的高倍视野,计算染色阳性细胞数并以百分比表示。PCNA阳性细胞判断:细胞核出现明显的深棕色;凋亡细胞细胞核出现棕黄色。

　　2 结果

　　2.1 给药结束后各组移植瘤细胞周期分析

　　给药结束后各组G0G1期和G2M期细胞百分数比较均无统计学意义。S期:DDP组和DDP+rhGH组比对照组或rhGH组明显降低(P<0.05);而rhGH组与对照组比较无差异(P>0.05)(图1、表1)。图1 给药结束后流式细胞仪检测胰腺癌移植瘤细胞周期扫描图

　　2.2 给药结束后各组移植瘤PCNA和AI

　　DDP组或DDP+rhGH组比对照组或rhGH组PCNA降低,且深棕色强度减弱,而AI明显升高(P<0.05);但是rhGH组与对照组或DDP+rhGH组与DDP组PCNA和AI比较无明显差异(P>0.05)(图2、3,表2)。　表1 给药结束后各组胰腺癌移植瘤细胞周期　表2 给药结束后胰腺癌移植瘤PCNA及AI　图2 给药结束后免疫组化检测胰腺癌移植瘤PCNA(×400) 图3 给药结束后Tunel法检测胰腺癌移植瘤细胞凋亡(×40)

　　3 讨论

　　由于胰腺癌恶性程度高,早诊断率低,预后差,患者总的5年生存率多在5.0%以下[3,4]。 胰十二指肠切除术是胰腺癌的有效手术,但该手术创伤大,患者都需要代谢调理治疗,而rhGH具有代谢调理作用和免疫调节作用,能改善机体的异常代谢状态,促进蛋白质合成,纠正负氮平衡,提高机体的免疫防御能力,增加患者对治疗的的耐受力,改善患者术后营养平衡,提高患者生存质量和延长生存期。临床上己证实,rhGH能改善负氮平衡,促进蛋白质合成,因此能提高术后机体抗应激能力和免疫功能,逆转手术创伤应激的分解代谢反应[5]，然而rhGH是否能促进胰腺癌细胞的增殖与分裂还存在争议。石毅等[6]经研究后发现,GH在体外能促进胰腺癌细胞SW1990增殖,但在体内不能促进种植瘤生长。有学者报道GH在体外能促进胰腺癌细胞Bxpc3细胞生长[7,8]。 Harrison等用hGH的小鼠血清培养人胰腺癌细胞,发现可显著促进癌细胞生长,另外Harrison在同一研究中给皮下接种了胰腺癌细胞的小鼠注射hGH,发现没有促进肿瘤生长,也未改变肿瘤细胞周期动力学[9]。有报道认为GH对肿瘤细胞增殖的作用因肿瘤病理类型而异,且很多GH刺激实验存在体内外差异、动物实验与临床实验的差异[10],同时造成这种差异的原因仍不明了。

　　PCNA是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36 kD的多肽,它是DNA多聚酶δ的一种辅助蛋白。其表达和合成与细胞的增殖周期有关,可精确判断癌组织中增殖细胞所占比例,PCNA的表达呈逐渐增加,在G1期、S期达到高峰,而G2/M期减少。PCNA被视为一种原位检测DNA合成期细胞的理想标记物[11]，有关PCNA在胰腺癌细胞表达的相关文献很少。本研究结果显示:DDP组、DDP+rhGH组与对照组、rhGH组比较,PCNA明显降低(P<0.05)，而rhGH组和对照组、DDP+rhGH组和DDP组比较无明显差异(P>0.05)，提示rhGH并不增加胰腺癌细胞中PCNA 的表达,这也说明GH在体内不能刺激胰腺癌细胞的增殖,也不改变其生物学行为,与流式细胞仪结果相吻合。

　　凋亡在肿瘤发生中有重要作用,机体可利用凋亡机制来清除突变细胞,避免肿瘤形成。但是胰岛素样生长因子Ⅰ(IGFⅠ)可以通过几个方面使有恶变倾向的细胞逃避凋亡而发展为肿瘤，对大多数细胞而言它也是最有效的抗凋亡因子。经典的FasFasL相互作用是细胞凋亡的重要作用,IGFⅠ可以通过下调Fas的表达而阻止凋亡的发生。在凋亡的调节过程中Bcl2分子是一个阻抑凋亡的核心分子,Bcl2x1的功能与之相似,IGFⅠ可以上调上述两个抗凋亡基因的表达[12,13];许多体外、体内的实验也都表明有效降低IGFs的水平后,肿瘤细胞的凋亡明显增加,肿瘤的生长就受到有效抑制。本研究结果显示DDP组和DDP+rhGH组比对照组或rhGH组凋亡指数明显升高(P<0.05)，而rhGH组与对照组比较无明显差异(P>0.05)，说明短期应用外源性hGH后,胰腺癌细胞的凋亡无明显变化。

　　我们的研究结果提示短期应用外源性hGH后,hGH在体内对胰腺癌细胞的细胞周期、PCNA和凋亡无明显影响,因此hGH在体内对胰腺癌细胞增殖分裂无促进作用,从而为临床胰腺癌患者应用rhGH进行代谢调理治疗提供实验依据，但其具体机制有待进一步研究。

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