口服姜黄素脂质体制备及其大鼠体内药动学考察

【摘要】  目的 制备卡波姆包衣姜黄素脂质体,并考察其在大鼠体内的药物动力学。方法 采用薄膜分散法制备姜黄素脂质体,通过孵育法对姜黄素脂质体进行卡波姆包衣。采用微柱离心法测定姜黄素脂质体包衣前后包封率的变化。姜黄素脂质体大鼠口服给药后,以高效液相色谱(HPLC)法测定大鼠血浆中的药物浓度。结果 脂质体包衣后包封率略有下降,姜黄素脂质体大鼠口服给药后药物动力学呈双室模型特征,相对生物利用度F(%)为281%,是普通脂质体的2.22倍。结论 姜黄素脂质体经卡波姆包衣可明显提高姜黄素的口服生物利用度,药物峰浓度显著增加。

【关键词】  卡波姆;姜黄素;脂质体;包封率;生物利用度

【Abstract】 Objective To prepare Carbopol coated curcumin liposomes,and investigate its oral pharmacokinetics in rats.Methods After prepared by film dispersion method,curcumin liposomes were coated with carbopol. Then minicolumn centrifugation method was adopted to determine the encapsulation efficiency (EE) before and after curcumin liposomes being coated. Drug concentration in rats plasma was detected by high performance lipid chromatography (HPLC) after curcumin liposomes administered to rats.Results The EE of curcumin liposomes decreased slightly after coated. Carbopol coated curcumin liposomes after oral administration in rats showed twocompartment model pharmacokinetic characteristics,and the relative bioavailability F(%) was 281%,which was 2.22 times as the noncoated curcumin liposomes.Conclusion After coated by carbopol,the oral bioavailability of curcumin liposomes can be significantly improved,and the maximum drug concentration also increased.

　　【Key words】 carbopol; curcumin; liposomes; EE; bioavailability

　　姜黄素(curcumin)是从姜黄、莪术、郁金根茎中分离出的活性物质之一。大量报道指出,姜黄素对癌症有预防及治疗作用。但姜黄素不溶于水,在体内吸收差、代谢半衰期短、生物利用度低且在中性和碱性的环境中易降解,这就给临床应用带来了很大的局限性[1]。本研究将姜黄素包封于脂质体中并进行卡波姆包衣,旨在改善姜黄素的体内行为,如增强药物在胃肠道中稳定性、延长药物在肠道的滞留时间,增加原型药物的口服吸收、延长体内半衰期、提高生物利用度。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料

　　卡波姆(美国NOVEON);姜黄素(Sigma,含量95%);Sephadex G50(Pharmacia);口服大豆磷脂(上海太伟药业有限公司);胆固醇(广东南方玻化进口分装);其它试剂均为色谱纯。Wistar大鼠(沈阳药科大学动物中心)。

　　1.2 仪器

　　LC10AT型高效液相色谱(日本岛津);ZFQ85A型旋转蒸发仪(上海医械专机厂);LIPEX挤出仪(Northern公司);TGL16G台式高速离心机(上海医分仪器制造有限公司);78HW1型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂)。

　　2 卡波姆包衣姜黄素脂质体的制备

　　采用薄膜分散法制备姜黄素脂质体。按质量比20∶1∶1精密称取口服大豆磷脂、胆固醇、姜黄素置于茄形瓶中,加入无水乙醇使脂质完全溶解。将茄形瓶置旋转蒸发仪上,50℃减压蒸发溶剂,使脂质溶液形成一层均匀薄膜,然后干燥过夜,除尽溶剂。加入pH 6.5 PBS 10 ml水化,水化液经0.8、0.45、0.22 μm滤膜高压挤出,得姜黄素脂质体。取等体积的姜黄素脂质体和质量浓度为0.5%的卡波姆溶液,室温下40 r·min-1磁力搅拌,孵育10 min,4℃冰箱中放置过夜,即得卡波姆包衣姜黄素脂质体[25]。

　　3 脂质体包封率的测定

　　3.1 分析方法的建立

　　3.1.1 色谱条件

　　色谱柱:C18柱Diamonsil(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈2%冰醋酸(58∶42);流速:1.0 ml·min-1;柱温:室温;检测波长:426 nm;进样量:20 μl.方法学考察结果表明:在本色谱条件下,脂质体中的辅料对姜黄素的测定无干扰。

　　3.1.2 线性关系的确定

　　配制质量浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg·ml-1的一系列姜黄素对照品溶液[67]。按上述色谱条件进样,以峰面积和质量浓度进行线性回归,得回归方程A=6.45×104C+8.15×103(R2=0.9998),在1.0～64.0 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好,且精密度和回收率均符合分析要求。

　　3.2 包封率的测定

　　采用微柱离心法测定姜黄素脂质体的包封率。制备5 ml葡聚糖凝胶微柱,依次用PBS(pH 6.5)和0.5 ml空白脂质体饱和微柱,2000 r·min-1离心3 min,弃去洗脱液。取0.3 ml姜黄素脂质体3份上样,以等体积PBS(pH=6.5)洗脱,2000 r·min-1离心3 min连续操作3次,平行测定3批。将离心液用甲醇破坏,流动相定容[810]。按“3.1.1”中色谱条件进样,按EE(%)=Wdrug/Wtot×100计算脂质体的包封率。表1 卡波姆包衣前后姜黄素脂质体包封率的变化

　　4 药动学试验

　　4.1 分析方法的建立

　　4.1.1 标准曲线的绘制

　　配制浓度为1 μg·ml-1的姜黄素甲醇储备液及4 μg·ml-1的大黄素甲醇储备液。精密吸取体积分别为6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μl的姜黄素储备液于EP管中,然后于每个EP管中各加入50 μl大黄素储备液。N2吹干后,精密吸取空白血浆样品200 μl分别加入各个EP管中,高速旋涡混合3 min,最终姜黄素在血浆中的浓度为30、50、100、150、200、250、300、350、400 ng·ml-1。以乙酸乙酯为萃取剂,按液液萃取法处理血浆,在“3.1.1”色谱条件下进样分析。以姜黄素的浓度(x)为横坐标,以待测药物的峰面积As与内标物的峰面积Ai之比As/Ai(y)为纵坐标,进行线性回归,见图1。回归方程为:y=0.0026x-0.0714,R2=0.9979;线性范围为0.03 mg·L-1～0.4 mg ·L-1。图1 大鼠血浆中姜黄素含量测定的标准曲线

　　4.1.2 精密度试验

　　将0.10、0.25、0.40 mg·L-1低、中、高3种姜黄素浓度的血浆样品处理后,每个浓度早、中、晚分别各进样3次,连续测定3天，计算日内精密度和日间精密度。测得药物浓度的日内精密度RSD(n=3)分别为1.76%、2.90%和3.61%;日间精密度RSD(n=3)分别为2.75%、3.40%和6.41%.符合生物样品分析方法的基本要求.

　　4.1.3 方法回收率

　　将0.10、0.25、0.40 mg·L-1低、中、高3种姜黄素浓度的样品溶液,按上述最优方案处理后,进样测定,每个浓度平行测定5次。由标准曲线计算测定值,将测定值除以理论值即为本方法的回收率，结果见表2.表2 大鼠血浆中姜黄素含量测定的方法回收率

　　4.1.4 萃取回收率

　　将0.10、0.25、0.40 mg·L-1低、中、高3个浓度的含药血浆样品处理后,进样分析,记录内标和各浓度姜黄素的色谱峰面积,相应浓度的姜黄素和大黄素混合溶液不经萃取也分别进样分析,记录峰面积。以每一浓度的血浆样品的峰面积和不经萃取的药物溶液的峰面积之比计算提取回收率，结果见表3.表3 大鼠血浆中姜黄素含量测定的萃取回收率

　　4.2 给药方法及样品的采集

　　Wistar大鼠15只,雌雄各半,体重230～270 g。随机分为3组,给药前禁食24 h,自由饮水。分别灌胃给予姜黄素混悬液(姜黄素含量2.5 g·L-1,称取姜黄素25 mg,加CMCNa 100 ml,涡旋混匀)、姜黄素脂质体(含姜黄素2.5 g·L-1)、卡波姆包衣姜黄素脂质体(含姜黄素2 g·L-1),给药剂量均为50 mg/kg。于给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h,经眼眶后静脉丛取血约0.5 ml,置涂有肝素的EP管中,10 000 r·min-1离心3 min,分离血浆。取血浆0.2 ml,立即置于-20℃冰箱中保存,直至分析[1113]。

　　4.3 血浆样品处理方法

　　以乙酸乙酯为萃取剂,按液液萃取法处理血浆样品。

　　4.4 HPLC法测定样品

　　将所得的乙酸乙酯萃取液用N2吹干,然后用100 μl流动相复溶,按“3.1.1”色谱条件进样分析。

　　4.5 数据处理

　　用DAS2.0软件对所得血药浓度数据拟和分析,结果表明姜黄素混悬液、姜黄素脂质体和卡波姆包衣姜黄素脂质体大鼠口服给药的药动学过程均符合双隔室模型(权重系数为1),其药-时曲线见图2.图2 姜黄素混悬液、姜黄脂质体、卡波姆包衣姜黄素脂质体大鼠口服给药后的药时曲线

　　5 讨论

　　5.1 由姜黄素对照品甲醇溶液在200～600 nm内扫描图可知,姜黄素在紫外和可见光区均有吸收。姜黄素在可见光区的吸收明显大于紫外区,同时考虑到在低波长处,生物样品中的内源性成分吸收较多,会对姜黄素的分析产生干扰,故将检测波长定为426 nm。在体外姜黄素的色谱条件下姜黄素、去甲氧基姜黄素及去二甲氧基姜黄素仍可较好地分离。

　　5.2 药代动力学参数结果显示:姜黄素脂质体的入血速度明显快于混悬液,说明姜黄素脂质体吸收快,磷脂起到促进吸收的作用。包衣组在5 h时出现血药浓度最大值,明显晚于前两者,说明药物从包衣脂质体有一段释放的时间。最大血药浓度Cmax和AUC(0t)的大小顺序为:卡波姆包衣脂质体>姜黄素脂质体>姜黄素混悬液,姜黄素脂质体组的Cmax是混悬液组的1.22倍,包衣脂质体组Cmax是混悬组的2.76倍。包衣脂质体的相对生物利用度F为281%,是未包衣脂质体的2.22倍,表明卡波姆包衣姜黄素脂质体与脂质体、混悬液相比，延缓了药物释放时间，提高了生物利用度。

　　从血药浓度曲线图中可以看出,姜黄素血药浓度时间曲线出现双峰的现象,其原因可能为肝肠循环所致。姜黄素在血浆中的主要代谢产物为姜黄素的葡萄糖醛酸结合物和磺酸盐，由此可推断,姜黄素在肝内与葡萄糖醛酸结合后,水溶性增高,分泌入胆汁,排入肠道,在肠道细菌酶作用下水解释放出原型药物,又被肠道吸收进入肝脏,形成肝肠循环,药时曲线出现双峰现象。

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