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【摘要】 目的 探讨反复自然流产与精子DNA完整性的相关性。方法 按纳入标准将研究对象分成反复自然流产患者丈夫组(n=58)和正常生育男性对照组(n=50)，采用吖啶橙实验(AOT)对研究对象精子DNA完整性进行检测，并对研究对象精液进行常规分析。结果 两组研究对象年龄、吸烟史、饮酒史无统计学差异(P>0.05)；反复自然流产患者丈夫组精液的精子密度、精子活力显著低于正常生育对照组(P<0.05)；反复自然流产患者丈夫组精子DNA的完整性低于正常生育对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 精子DNA完整性损伤是反复自然流产的可能原因，精子DNA完整性损伤导致反复自然流产的致病机理尚需进一步研究。
【关键词】 反复自然流产；精子；DNA
反复自然流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)的发生率为1%-5%，其发病机制尚未完全阐明，可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、染色体异常、感染及基因多态性等有关，由于其发病原因不明，给临床治疗带来困难［1-4］。
精子DNA是精子遗传物质的载体，近年来的研究表明精子DNA的完整性能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的发育［5-7］。为了评估精子DNA完整性在反复自然流产中的可能作用，我们对反复自然流产患者丈夫精子DNA完整性和正常生育男性精子DNA完整性进行了检测，并比较了两组间在精子DNA完整性和精液常规方面的差异。
1 对象与方法
1.1 研究对象 本组58例反复自然流产患者丈夫(反复自然流产组)，年龄25-36岁，来自西安交通大学医学院第一附属医院男科门诊；50例正常生育男性自愿者作为对照组(正常对照组)，年龄24-33岁，其配偶至少有一次生育史且无自然流产史。反复自然流产患者的纳入标准参照Buchholz等［8］的标准。对研究对象的年龄、饮酒史、吸烟史等基本资料进行统计，以平均每日吸烟超过10支，连续吸烟6个月及以上为吸烟，以平均每日饮酒量50 mL(纯乙醇量)，连续6个月及以上为饮酒。
1.2 主要试剂与仪器 WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，吖啶橙(美国Sigma公司)。
1.3 标本采集 受检者应禁欲3-7 d，用手淫或体外排精法收集一次排精的全部精液，留于清洁收集器皿内，标明采集时间，置37 ℃培养箱内，液化后进行精液常规分析。
1.4 精液分析 采用国产WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统软件配合载物台温控仪以及计算机操作，参照《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》［9］对精子密度、精子活力和精子活力分级进行分析。
1.5 精子DNA完整性检测 采用吖啶橙实验(acridine orange test, AOT)染色对精子DNA完整性检测［10］。将液化后精子进行精液分离，1 500 r/min离心10 min，去除精浆，以37 ℃ 0.01 mol/L PBS液洗涤沉淀3次，将精子制备为精子悬液，然后将精子悬液涂片，风干后以Carnoy液(3份甲醛与1份冰醋酸混合)固定过夜；固定后的精子涂片以吖啶橙染液染色5 min，蒸馏水洗片3次，风干后行荧光显微镜检(放大400倍，激发波长为460 nm)。为了保证检测结果的可靠性，染色后的精子涂片须立即观察，防止荧光淬灭。经染色后，正常精子DNA呈双链在激发光下呈绿色，而变性或受损的精子DNA则断裂为单链呈黄色或红色。在荧光显微镜光镜同一视野下随机计数200个精子，以异常精子所占的百分比来表示精子DNA受损程度。
1.6 统计学分析 采用SPSS13.0进行数据处理，计数资料以x±s表示，组间比较采用t检验和χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 研究对象基本情况 对研究对象基本资料进行统计，以平均每日吸烟超过10支、连续吸烟6个月及以上为吸烟，以平均每日饮酒量50 mL(纯乙醇量)，连续6个月及以上为饮酒。两组患者在年龄、饮酒史、吸烟史等方面无统计学差异(P>0.05，表1)。 表1 研究对象的基本状况
2.2 精子活力检测结果 反复自然流产组和正常生育对照组精子密度及活力检测结果见表2。
2.3 精子DNA完整性检测结果 反复自然流产组和正常生育对照组精子DNA受损程度分别为(75.4±7.5)%和(30.2±5.8)%，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。表2 反复自然流产组和正常生育对照组精子密度及活力
3 讨 论
反复自然流产是妇产科常见病。近年来的研究表明其可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、染色体异常、感染及基因多态性等有关，但是其确切病因尚不清楚。
常规的精液分析能够从精子密度、精子活力和精子形态等方面反映精液质量，但是其在精子功能的评价方面价值有限，不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响。近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性，并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育［5-7］。精子DNA是遗传信息的载体，精子DNA的完整性对种族的繁衍具有重要意义，但是精子生成过程中染色质的浓缩异常、受损精原细胞的凋亡异常、环境毒物以及不良的生活习惯都会造成精子DNA损伤。
吖啶橙是一种荧光络黄染料，具有高度的异染性，吖啶橙以插入的方式与双螺旋的DNA分子结合；在激发波照射情况下，当与双链DNA结合时呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合时呈聚合物形式发出红色或黄色荧光［11］。而精子DNA损伤的特征性改变为精子DNA单链形成和双链断裂［12］，所以吖啶橙实验被用来检测精子DNA损伤。精子经吖啶橙染色后，可以采用荧光显微镜检或流式细胞仪对染色结果进行判定，由于荧光显微镜检操作简单和经济而被广泛使用［13］。
本研究为了探讨精子DNA完整性在反复自然流产中的可能作用，对反复自然流产患者丈夫和正常生育对照男性精子DNA完整性进行了检测，并对研究对象精液进行了常规分析。研究结果表明反复自然流产组精子DNA完整性显著低于正常对照组，而且反复自然流产组精子密度和精子活力也显著低于正常对照组，但是精子DNA完整性受损是否是导致精子密度和精子活力下降的原因尚不清楚。
综上所述，精子DNA完整性与反复流产有显著的相关性，并且反复自然流产患者丈夫精液常规存在异常。然而，精子DNA完整性损伤导致反复流产的致病机理尚需进一步研究。
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作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061