红景天甙对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的 探讨红景天甙对大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的预防和保护作用。方法 将32只健康成年SD大鼠随机分成正常对照组、假手术组、缺血再灌注组和红景天甙组4组，每组8只。缺血再灌注组和红景天甙组分别制作肾脏缺血再灌注模型，红景天甙组予以红景天甙预处理。检测血中尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)及肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酰二醛(MDA)和钠钾ATP酶(Na＋K＋ ATPase)含量，并用光镜和电镜观察肾脏组织形态学变化。结果 红景天甙组血清BUN和Scr水平、肾皮质MDA含量较缺血再灌注组显著降低(P<0.01)，而肾皮质中SOD和Na+K+ ATPase含量与缺血再灌注组相比显著升高(P<0.01)；肾组织光镜和电镜观察均见缺血再灌注组肾小球和肾小管上皮细胞损伤明显，而红景天甙组肾小球及肾小管仅见轻微损伤。结论 红景天甙能有效降低大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)，对肾脏IRI有明显的预防和保护作用，为临床上肾脏IRI提供新的预防和治疗思路。

【关键词】  红景天甙；缺血再灌注损伤；大鼠；肾脏

The protective effect of salidroside on renal ischemia/reperfusion injury in rats

    Li Junlong1, Sun Zeyu2, Chen Ming2, Zhang Gutian2, Yan Jiajun1, Yue Wenyan3, Zheng Changwu3

    (1. Department of Urology, The Peoples Hospital of Shaoxing, Shaoxing 312000; 2. Department of Urology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University, Nanjing 210029; 3. Medical School of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)ABSTRACT: Objective  To explore the protective mechanism of salidroside on rat renal ischemia/reperfusion injury. Methods  32 healthy male adult SD rats were divided into the control group, sham group, ischemia/reperfusion group and saldroside group at random. The model of renal ischemia/reperfusion was made in the ischemia/reperfusion and the saldroside, and saldroside was injected into the rats of the saldroside. The detection of the level of BUN, Scr, SOD, MDA and Na+K+ ATPase, and the observation of renal histomorphology was performed in every rat. Results  Animals that underwent renal I/R exhibited significant increase in the serum concentrations of creatinine, urea nitrogen and the level of the renal MDA as compared to animals treated with saldroside, while the level of SOD and Na+K+ ATPase significantly decreased. Severe histomorphological changes were observed in the ischemia/reperfusion, but less injury in the saldroside. Conclusion  Rat renal ischemia/reperfusion injury can be attenuated by administration of saldroside. It can be a favorable choice for protection of renal ischemia/reperfusion injury.

    KEY WORDS: saldroside; ischemia/reperfusion injury; rat; kidney摘要：目的  探讨红景天甙对大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的预防和保护作用。方法  将32只健康成年SD大鼠随机分成正常对照组、假手术组、缺血再灌注组和红景天甙组4组，每组8只。缺血再灌注组和红景天甙组分别制作肾脏缺血再灌注模型，红景天甙组予以红景天甙预处理。检测血中尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)及肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酰二醛(MDA)和钠钾ATP酶(Na＋K＋ ATPase)含量，并用光镜和电镜观察肾脏组织形态学变化。结果  红景天甙组血清BUN和Scr水平、肾皮质MDA含量较缺血再灌注组显著降低(P<0.01)，而肾皮质中SOD和Na+K+ ATPase含量与缺血再灌注组相比显著升高(P<0.01)；肾组织光镜和电镜观察均见缺血再灌注组肾小球和肾小管上皮细胞损伤明显，而红景天甙组肾小球及肾小管仅见轻微损伤。结论  红景天甙能有效降低大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)，对肾脏IRI有明显的预防和保护作用，为临床上肾脏IRI提供新的预防和治疗思路。

    关键词：红景天甙；缺血再灌注损伤；大鼠；肾脏

     肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia/reperfusion injury, RIRI)在临床上常见，肾移植、肾血管外科及体外冲击波碎石等都会引起RIRI。由于IRI导致不正常的信号转导和细胞功能异常，激发了细胞的凋亡和坏死，从而影响肾功能的恢复。据报道IRI引起的急性肾小管坏死死亡率很高[1]。降低IRI所引起的肾损害，促进肾功能恢复已成为一个重要研究课题。国内外文献报道藏药红景天的有效成分红景天甙有明显的抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、延缓机体衰老、防治老年疾病等功能[24]，并应用于军事、航天和运动医学上。有文献报道红景天甙对动物的心肌[5]、小肠[6]及大脑缺血再灌注损伤[7]有良好的保护作用。本实验通过建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型来研究红景天甙对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，为RIRI的治疗提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物模型和分组处理  健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠32只，体重200-250g，由南京医科大学实验动物中心提供，经适应性喂养6-8d后用于实验。随机分成正常对照组、假手术组、缺血再灌注组、红景天甙组，每组8只。大鼠术前禁食12h，自由饮水，使用氯胺酮腹腔注射麻醉(40mg/kg)。正常对照组：麻醉后腹部剪毛、消毒，取耻骨联合至剑突下切口沿腹白线剪开进入腹腔和胸腔，取心脏血测尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)，取右肾作病理光镜和电子显微镜检查，左肾迅速投入-176℃液氮罐中备作超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酰二醛(MDA)和钠钾ATP酶(Na+K+ ATPase)测定。假手术组：不夹闭双侧肾蒂，其余同缺血再灌注组。缺血再灌注组：实验前第5、4、3、2、1天每天每只大鼠腹腔注射1.5mL生理盐水(NS)，游离左右肾蒂，无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂45min后开放血流，关闭腹腔，24h后再次进入腹腔和胸腔，取血和左右肾脏，检测同正常对照组。红景天甙组：实验前第5、4、3、2、1天每天每只大鼠腹腔注射1.5mL红景天甙(按20mg/kg配入NS)NS混合液，以后步骤同缺血再灌注组。

    1.2  试剂和仪器  红景天甙对照品：中国药品生物制品检定所。全自动生化分析仪：日本日立公司；光学显微镜：日本奥林巴斯公司；JSM6800LV电子显微镜：日本电子公司。

    1.3  指标检测

    1.3.1  血BUN、Scr的检测  用全自动生化分析仪测血液BUN、Scr。

    1.3.2  SOD、MDA和Na+K+ ATPase测定  肾皮质匀浆后按试剂盒(南京建成生物工程公司)说明书操作。

    1.3.3  肾组织光学显微镜观察  取肾组织用10%(体积分数)中性甲醛溶液固定，按常规脱水、浸蜡、切片，苏木素伊红(HE)染色，暗视野下显微镜观察。

    1.3.4  肾组织电子显微镜观察  取4mm×2mm×1mm肾组织,依次用pH7.4的25mL/L戊二醛磷酸缓冲液4℃下预固定2h，用pH7.38的磷酸缓冲液冲洗3次共1h，用pH7.38的10g/L锇酸固定2h，再冲洗3次共1h，常规脱水、包埋、超薄切片(1μm)、染色，电子显微镜观察。

    1.4  统计学分析  采用SPSS10.0数据统计分析软件进行OneWay ANOVA分析。比较各组之间差异性采用LSD法和Dunnett法，检验水准为α＝0.05。

    〖2〗现代泌尿外科杂志〖3〗第13卷

    3期〖2〗李俊龙，孙则禹，陈  明，等. 红景天甙对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

    2  结    果

    2.1  BUN、Scr、SOD、MDA、Na+K+ ATPase的测定结果  各组大鼠BUN、Scr、SOD、MDA、Na+K+ ATPase含量改变见表1。表1  各组大鼠BUN、Scr、SOD、MDA、Na+K+ ATPase检测结果
    *P<0.05 vs. 正常对照组；△P<0.05 vs.缺血再灌注组

    2.2  肾组织光学显微镜观察结果  正常对照组与假手术组肾小球、肾小管结构清楚，无明显改变。缺血再灌注组部分肾小球轮廓基本清楚，肾小管排列疏松、紊乱，上皮细胞明显肿胀，部分肾小管管腔扩张，并有透明管型，间质水肿，大量炎性细胞浸润(图1)。红景天甙组肾小球、肾小管轮廓清楚，少数上皮细胞轻度水肿，少数细胞有轻度空泡变性，偶有炎性细胞浸润(图2)。

    2.3  肾组织电子显微镜观察结果  正常对照组和假手术组肾小球足突排列规则、整齐，内皮细胞无明显空泡；肾小管微绒毛排列整齐，线粒体膜完整，嵴清楚。缺血再灌注组肾小球足突局部有肿胀，排列欠规则，内皮细胞肿胀，有较大空泡，胞浆疏松水肿，肾小管上皮细胞肿胀明显，水肿液潴留多，线粒体散在分布，微绒毛大部分消失，残存少量，且形态不规则，肿胀，空泡变性；线粒体大部分空泡、肿胀，基质浓集，嵴 红景天甙组电镜下观察结果 (×12000)断裂，少部分正常，胞浆内出现空泡变性(图3)。红景天甙组肾小球足突基本完整，排列整齐，无明显肿胀，内皮细胞无肿胀、空泡；肾小管线粒体形态大部分正常，膜完整，嵴清楚，个别膜稍模糊，部分微绒毛肿胀、空泡变性，靠近胞浆部正常(图4)。

    3  讨    论

    RIRI常发生在大血管手术、休克、器官移植、复杂性肾结石取石术、体外冲击波碎石及肾肿瘤的保肾手术等过程中，并可导致急性肾功能衰竭。缺血及之后再灌注的恢复发挥了重要作用[89]。缺血引起损伤的主要原因有能量耗竭、代谢废物聚集、水电解质特别是Ca2＋的平衡紊乱[1013]。而再灌注损伤则主要由氧自由基介导[1418]。研究证实，SOD活性间接反映机体清除氧自由基的能力，而MDA含量可反映机体组织细胞受自由基攻击的严重程度，ATPase活性改变是肾脏缺血损害的标志之一，也是再灌注损伤的重要环节。本实验结果显示， 肾IRI 24h后MDA含量明显升高，SOD活性和Na+K+ ATPase含量显著下降，表明IRI后产生氧自由基，导致脂质过氧化损伤，且消耗大量ATPase。用红景天甙预处理后SOD活性和Na+K+ ATPase含量升高，MDA含量降低，肾脏组织形态改善，提示红景天甙对肾IRI大鼠有一定的保护作用，其作用机制可能是红景天甙具有清除氧自由基，抑制细胞膜脂质过氧化作用和减少ATPase的消耗。另外，实验结果也表明红景天甙组与正常对照组相比肾功能指标中BUN和Scr仍较高，亦有显著性差异，提示红景天甙对RIRI虽有很强的保护作用，但仍未达到完全无损伤的程度。这也说明了IRI机制是个多因素参加的复杂的病理生理过程，值得我们进一步研究探索。另外，本实验红景天甙剂量为20mg/kg，增加或减少剂量是否能增强保护作用尚未可知，这也是下一步研究方向之一。

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作者单位：绍兴市人民医院泌尿外科，浙江绍兴 312000