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【摘要】 目的分析湖南地区儿童β-地中海贫血患儿珠蛋白基因缺陷类型,为开展相关的研究与治疗提供依据。方法通过血液常规检查、血红蛋白电泳和红细胞渗透脆性分析筛查地中海贫血患儿，用PCR法扩增目的基因，使用反向膜杂交技术检测靶基因，判断基因突变类型，检测中国人8个常见及9个罕见β-地中海贫血基因突变位点。结果206例儿童β-地中海贫血中突变基因类型共有17种，分别为纯合子13例，基因型是CD41-42(2.43 %)，IVS-2-654(3.39 %)和CD17(0.49 %)；杂合子175例，常见的基因型是CD41-42(40.77 %)，IVS-2-654(22.81 %),CD17(7.76 %),-28(7.28 %)，CD71-72(2.43 %)；双重杂合子18例,基因型是CD41-42/IVS-2-654(2.43 %)，IVS-2-654/-28(1.94 %)，CD41-42/CD17(1.46 %)，IVS-2-654/CD17(0.97 %)，CD41-42/CD27-28(0.49 %)，IVS-2-654/CD71-72(0.49 %)，IVS-2-654/-29(0.49 %)，CD41-42/-28(0.49 %)。结论 本研究发现湖南地区儿童β-地中海贫血患儿β-珠蛋白基因缺陷类型共有17种，β-地中海贫血基因突变类型分布存在区域差异。
【关键词】 β-地中海贫血 β-珠蛋白基因 基因突变 类型分析
β-地中海贫血是由于β-珠蛋白肽链合成受到部分或完全抑制，造成肽链合成不平衡所引起的一组遗传性溶血性贫血，是由于β-珠蛋白基因缺失或突变引起的一组血红蛋白病，属常染色体不完全显性遗传性疾病，我国南方地区多见，我省也比较常见。张秀峰等[1]对深圳地区3 068名育龄人群携带地中海贫血基因状况的调查发现湖南地区携带地中海贫血基因者达5 %左右，次于广东、广西、福建。笔者分析了湖南地区儿童β-地中海贫血患儿的β-珠蛋白基因缺陷类型和临床特征，为减少/控制β-地中海贫血基因的遗传提供科学的理论依据，现报道如下。
1资料与方法
1.1 对象
选取2007年5月至2009年3月在湖南省儿童医院门诊和住院的疑为地中海贫血的患儿，每个患儿同时做血常规和红细胞渗透脆性分析，对筛查阳性者进行血红蛋白电泳及地中海贫血基因诊断。共确诊β-地中海贫血206例,年龄2月至12岁,男97例,女109例,均为湖南籍；所有患儿采血前3月均无输血。
1.2 方法
1.2.1血液细胞分析
采用日本Sysmex XS800i血细胞分析仪及原装配套试剂做血液常规分析,实验前严格按操作规程进行质控。记录红细胞平均体积（MCV）,红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）及红细胞体积分布宽度（RDW）值。正常参考值为MCV 82～94 fL,MCHC 260～320 g/L,RDW 0.11～0.16。
1.2.2“一管法”[2]
采用广东米基公司的试剂及方法做“一管法”红细胞渗透脆性分析,以红细胞脆性>60 %为正常。
1.2.3血红蛋白电泳分析
采用法国西比亚公司的电泳仪及原装配套试剂做血红蛋白电泳。各种不同血红蛋白含量在不同年龄儿童的正常参考范围详见试剂盒说明书。
1.2.4 基因诊断
采用深圳益生堂公司提供的β-地中海贫血基因诊断试剂盒。（1）用无菌抗凝管新采集柠檬酸钠抗凝全血或-20 ℃以下保存的柠檬酸钠抗凝全血2 mL混匀，分离血浆与血细胞，-85 ℃存放，外周血DNA提取筛查出的阳性标本采用常规酚—氯仿抽提法抽提基因组DNA(由深圳益生堂公司提供说明书)。（2）聚合酶链式反应（PCR）扩增反应 PCR扩增管标号，分别加入45 μL PCR反应混合物至含有扩增所需的DNA多聚酶各管中；吸取2 μL处理样本上清液至PCR反应管中，混匀，5 000 r/min离心30 s。然后按下列参数进行PCR反应：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 60 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s）×35个循环→72 ℃ 5 min。（3）杂交 取15 mL塑料离心管，标明患者编号，放入同样标有患者编号的膜条，加入A液（2×SSC,0.1 % SDS,pH 7.4）12 mL，加入1支PCR产物，拧上离心管盖。将塑料管放入沸水中加热10 min，取出，放入42 ℃杂交箱或水浴箱杂交（杂交时间应长于2 h），同时取1只50 mL塑料管，加入40 mL B液（0.5×SSC,0.1 % SDS,pH 7.4），拧紧盖子，一并置于42 ℃杂交箱或水浴箱中进行预热（至少0.5 h）。（4）洗膜取出膜条，移至装有预热B液的50 mL管中，于42 ℃轻摇洗涤30 min（每管40 mL溶液）。（5）显色液配制1∶4000的POD溶液（2张膜以下用3 μL POD母液配制成）12 mL使用液在15 mL离心管中进行操作，多于2张膜时请选择适当的容器，如合适大小的培养皿，配制可以淹没所有膜的1∶4000的POD溶液，配置好的POD溶液在密封情况下于4 ℃可存放1个星期），室温轻摇浸泡30 min，用镊子小心取出膜条，剩下的POD溶液可置4 ℃存放，可重复使用1次。用A液在平皿中室温轻摇洗膜2次，每次5 min，再用C液（柠檬酸钠14.7 g溶于450 mL纯化水，用浓盐酸调pH值至5.0，最后定容至500 mL）室温轻摇洗膜2次，每次2 min，同时配制新鲜显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色约10 min，将显色的膜条在纯水中快速漂洗1次，进行结果判定。检测中国人8个常见及9个罕见β-地中海贫血基因突变位点:CD41-42（-TCTT），IVS-2-654（C→T），CD17（A→T），-28（A→G），CD26（G→A），CD71-72（+A），CD43（G→T），-29（A→G），起始密码子ATG→AGG，CD14-15（+G），CD27-28（+C），-32（C→A），-30（T→C），IVS-1-1（G→T），IVS-1-5（G→C），CD31（-C），CAP+40—+43（-AAAC）。(6)结果判断观察膜条上出现的蓝色斑点,在野生型探针相应的位点出现蓝色斑点即为该位点的基因突变(见图1)。图1显色后的ＲＤＢ膜条
注：（A）17个位点未见突变；（B）CD41-42(-TCTT)/IVS-2-654（C→T）双重杂合子；（C）CD41-42(-TCTT)纯合子
2结果
通过β-地中海贫血筛查和血红蛋白电泳，最后经基因诊断确诊β-地中海贫血患儿206例，其突变基因类型共有17种，分别为纯合子13例，基因型分别是CD41-42(2.43 %)，IVS-2-654(3.39 %)和CD17(0.49 %)；杂合子175例，常见的基因型分别是CD41-42(40.77 %)，IVS-2-654(22.81 %),CD17(7.76 %),-28(7.28 %)，CD71-72(2.43 %)；双重杂合子18例,基因型分别是CD41-42/IVS-2-654(2.43 %)，IVS-2-654/-28(1.94 %)，CD41-42/CD17(1.46 %)，IVS-2-654/CD17(0.97 %)，CD41-42/CD27-28(0.49 %)，IVS-2-654/CD71-72(0.49 %)，IVS-2-654/-29(0.49 %)，CD41-42/-28(0.49 %)。其基因型及基因频率分别见表1～2。表1β-地中海贫血基因突变纯合子、杂合子分布频率例
3讨论
1925年Thomas Cooley和Pear Lee首次描述这种发生在意大利儿童的严重贫血。1932年George H，Whipple，William L，Bradford等又发表了有关这类疾病的报道[1]。由于早期的病例均发生在地中海国家，所以又称为地中海贫血或海洋性贫血。但以后发现这种疾病不只限于地中海国家，而是广泛发生于热带国家的遗传性疾病，呈世界性分布。我国以长江以南各省发病率高，除广东、广西、海南省等发病率最高外，福建、贵州、云南、四川等也是高发区[3]。β-地中海贫血是高度异质性单基因遗传病，β-地中海贫血分子遗传流行病学资料显示，目前全世界约有1.5亿以上人口携带地中海贫血基因[4]。迄今为止,世界范围已发现200多种β-地中海贫血的基因突变类型，我国报道有23种[5]，其基因突变类型和频率具有明显的种族性和地域性差异。目前对于重型患者的治疗还没有可以大规模推广的良方，虽然高效输血加铁鳌合剂是基本的治疗措施，造血干细胞移植(包括骨髓、外周血、脐血)是目前根治本病的唯一治疗方法，但受供体来源、并发症、治疗费用及技术难度等方面因素影响，只能治愈部分患者，故难以进一步推广应用。而基因导入、基因改造、药物调控基因表达等治疗手段效果尚不确定，尚在实验研究阶段[6]，故临床上逐步减少/控制β-地中海贫血基因的遗传是预防的关键，对夫妇双方皆为地中海贫血基因携带者的孕妇进行产前基因诊断，杜绝重症β-地中海贫血患儿的出生，是降低地中海贫血的发生率及逐渐消灭本病的最佳措施。
本文统计结果表明，湖南地区β-地中海贫血基因突变发生频率分别为CD41-42(40.77 %)、IVS-2-654(22.81 %)、CD17(7.76 %)、-28(7.28 %)、CD71-72(2.43 %)。本文13例β-地中海贫血纯合子和18例双重杂合子均表现出中、重度贫血状态。1996年杜传书[7]列出我国人群β-地中海贫血基因突变频率依次为CD41-42(41.6 %)、IVS-2-654(21.9 %)、CD17(18 %)、-28(8 %)、CD71-72(3.9 %)，本文报道数据与此较为接近。本文结果与广东、广西、贵州等地的相关报道差异不大[6，8]，考虑与地理位置毗邻相关，但与深圳有关研究结果相差较大[9],可能与深圳这座“移民城市”的人口背景有关。本研究进一步证明β-地中海贫血基因突变类型的分布存在区域差异[10]。
地中海贫血的遗传方式与性别无关,大部分为地中海贫血携带者，即杂合子，虽然临床症状较轻，但两个杂合子的任何一个后代都有1/4的机会成为β-地中海贫血基因的纯合子或双重杂合子,而这种双重杂合子或纯合子则出现明显临床症状，表现为严重溶血性贫血、黄胆、肝脾肿大、骨变形、生长迟缓等特征，通常在青春期前死亡[11-12]，给家庭和社会造成严重的负担。故有针对性地进行基因诊断及产前诊断，对防止重型患儿的出生很有必要。
β-地中海贫血分子基础及遗传方式较明确，也是世界上少数几种通过人群干预可以预防的常见人类单基因遗传病之一。当前的首要任务是要进行地中海贫血出生缺陷的干预工作。目前常用的基因诊断方法已较成熟，可简便、高效、准确、快捷地诊断β-地中海贫血患者及携带者的基因类型。本研究初步明确了湖南地区最常见的β-地中海贫血基因突变类型，这为以后在该地区开展β-地中海贫血的产前基因诊断提供了有益的资料，可在临床诊断中被广泛使用。近年来，随着社会经济的发展，我国人口的迁徙与流动更加活跃，由于我省人口密集，且与地中海贫血的高发区广东、广西毗邻,两个同型地中海贫血的人结婚的机会很多。所以本研究对于扩大筛查面,特别对育龄人群进行筛查、基因诊断可提供有效帮助，有利于积极开展社会宣教、遗传咨询、产前诊断等工作，从而达到优生优育，降低地中海贫血的发生率，提高人口质量，减轻社会和家庭负担。但本研究病例有限，有待进一步补充。
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作者单位：湖南省儿童医院血液科，湖南长沙 410007