尼莫地平对HL60细胞凋亡的影响及其机制

　　［摘要］  目的  研究尼莫地平（NMDP）对HL60细胞的作用及其机制。方法  取对数生长期HL60细胞并调整细胞浓度为5×108/L，分为对照组和实验组，置24孔板培养，每孔加入HL60细胞培养液1.5 mL，实验组各孔再加NMDP 0.01 g/L。分别培养0、8、16、24 h，通过倒置显微镜观察细胞的动态变化；采用Giemsa染色光学显微镜下观察细胞的形态学变化；琼脂糖凝胶电泳检测DNA的碎片；流式细胞仪检测DNA含量；细胞免疫组化方法检测细胞凋亡相关基因bcl2、bax的蛋白表达。结果  实验组细胞从培养8 h起，可见不同程度的变形、出泡，细胞和小泡仍保持膜的完整性，随着培养时间延长，出泡细胞增加，细胞体积变小，部分细胞裂解；对照组细胞一直无形态学变化。Giemsa染色可见实验组细胞核膜裂解，染色质呈紫红色或蓝紫色，分割成块状，浓缩、靠近核膜，呈边集现象，并有典型的凋亡小体形成；对照组细胞保持大小一致，胞内染色质呈紫红色或蓝紫色，分布均匀。DNA凝胶电泳显示，实验组在8、16、24 h出现典型的梯形带。实验组细胞的凋亡率随时间延长而增加，自8 h起与对照组差异有显著意义(t=15.06~20.75,P<0.01)。实验组Bcl2蛋白表达下降，16、24 h与对照组比较差异有显著意义(t=3.66、5.62，P<0.05)；Bax蛋白表达升高，与对照组比较，16、24 h有显著性差异(t=4.13、7.55，P<0.01)。Bcl2／Bax蛋白表达比值逐渐下降，与对照组比较，8、16、24 h差异皆有显著性(t=5.32~7.76，P<0.05)。结论NMDP可诱导HL60细胞凋亡。Bcl2／Bax蛋白比值下降，可能是NMDP诱导HL60细胞凋亡的机制之一。

　　［关键词］  尼莫地平；细胞凋亡；HL60细胞系；基因表达

　　EFFECT OF NIMODIPINE ON HL60 CELL APOPTOSIS AND ITS MECHANISM

　　GAO BINCHANG,  SUN LIRONG

　　(Department of Paediatrics, Hiser Medical Group, Qingdao 266033, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of Nimodipine on HL60 and its mechanism.MethodsThe standard HL60 cells were divided into control and experimental groups. Nimodipine (0.01 g/L) was added into the experimental group. The dynamic changes were observed through an inverted microscope and morphological changes through a microscope with Giemsa method. The DNA fragments were detected through agarose gel electrophoresis. The content of DNA was analyzed through a flow cytometer. The expression of apoptosisrelated genes bcl2 and bax were investigated using immunohistochemical technique.Results  In experimental group: from after eight hours of cell culture, the cells showed deforming, bubbling; while the membrane of the cells and bubbles remained integrity. With the extension of the culture time, the number of bubbled cell increased, cell capacity decreased, some cells split; no morphological changes were noted in the control group. With Giemsa staining, the split of cell membrane was seen and the chromatin appeared as purplish red, and concentrated into pieces, approaching to nuclear membrane, gathering to the edge and forming typical apoptosis bodies. DNA ladders on agarose gel were clearly seen at 8 h, 16 h and 24 h in the experimental group. The apoptosis rate increased in the experimental group with time elongating, being markedly statistically significant from 8 h compared with the control one. The optical density (OD) values of Bcl2 protein expression obviously decreased in the experimental group, being different (t=3.66,5.62; P<0.05) by 16 h and 24 h compared with the control group. The OD values of Bax obviously elevated, being different (t=4.13, P<0.05) by 16 h and significantly different (t=7.55,P<0.01) by 24 h compared with the control group. The rate of bcl2/Bax protein descended and showed a significant difference (t=5.32-7.76,P<0.01) by 8 h, 16 h and 24 h compared with the control group. ConclusionNimodipine could effectively induce apoptosis of HL60 cells. The decrease of the proportionality of Bcl2/Bax protein might be one of the mechanisms inducing apoptosis of HL60.

　　［KEY WORDS］Nimodipine; apoptosis; HL60 cell line; gene expression
   
　　化疗是治疗白血病的主要手段。细胞凋亡受抑不仅在肿瘤发生中起重要作用，而且是肿瘤化疗、放疗中产生多药耐药的主要机制之一。白血病多药耐药性(MDR)的产生是导致化疗失败的一个重要原因之一［1］，寻找新药和化疗增效剂成为白血病治疗的热点。近年来研究发现，利用尼莫地平（NMDP）联合DA方案可提高单用DA方案治疗效果不佳的急性非淋巴细胞性白血病病儿的疗效［2］；体外研究也显示，NMDP的浓度为0.01 g/L时能明显地增加阿糖胞苷（Arac）诱导HL60细胞的凋亡率［3］，但其作用机制尚不清楚。本文采用HL60细胞株为研究对象，观察NMDP对HL60细胞凋亡率及Bcl2、Bax表达的影响，以探讨NMDP对HL60细胞的影响及作用机制，为临床应用提供理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验材料

　　HL60细胞株，引自武汉大学典型培养物保藏中心。NMDP购自德国拜耳公司。Rabbit Antibcl2、Rabbit Antibax、SABC试剂盒均购自武汉Boster公司。基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳Marker购自上海生物工程有限公司。

　　1.2  细胞培养

　　HL60细胞加入含体积分数0.10新生牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素0.1 g/L的RPMI1640培养液中，于含体积分数0.05的CO2、37 ℃饱和湿度的恒温箱中悬浮培养，每2~3 d传代一次。

　　1.3  实验分组

　　取对数期生长细胞并调整细胞浓度为5×108/L，分为对照组(n=4)和实验组(n=4)，置24孔板培养，每孔加细胞培养液1.5 mL，实验组各孔再加NMDP 0.01 g/L。

　　1.4  细胞形态学观察

　　分别取两组培养0、8、16、24 h的HL60细胞于Olympus倒置显微镜下观察其形态变化。然后离心，涂片，干燥，甲醇固定，常规Giemsa染色，在Olympus BH2光学显微镜下观察细胞形态学变化。

　　1.5  DNA琼脂糖凝胶电泳

　　取两组培养0、8、16、24 h的HL60细胞各1.5×106个，按照DNA抽提试剂盒的说明提取DNA，冷乙醇洗涤2次，最后在25 g/L的琼脂糖凝胶块上电泳（4 V/cm）1 h，紫外线灯下观察DNA电泳条带。

　　1.6  DNA含量分析
　　
　　取各组培养不同时间细胞各106个，PBS洗涤2次，4 ℃、体积分数0.70乙醇固定24 h，PBS洗去乙醇后加入RNA酶去除RNA，100 μL（50 mg/L）的碘化丙啶避光染色1 h，流式细胞仪（FACS 420）进行DNA含量分析。低于G0/G1的DNA含量的细胞为凋亡细胞。

　　1.7  Bcl2、Bax蛋白表达检测

　　采用免疫组化方法。取培养0、8、16、24 h的HL60细胞各106个，离心，涂片，干燥，丙酮固定30 min。浸泡于H2O2和甲醇混合液（体积分数0.30 H2O2 1份，甲醇50份）中30 min，然后加入pH 7.8的1 g/L胰酶液中37 ℃消化10 min，PBS洗涤3次后，按照试剂盒说明进行免疫组化染色，其中阴性对照组不加一抗，改加PBS。最后加DAB试剂显色后，脱水、透明、封片、照相。图像扫描测定积分吸光度值（A）。

　　2  结果

　　2.1  细胞形态学观察

　　实验组细胞从培养8 h起，可见不同程度的变形、出泡，小泡散落于细胞周围，细胞和小泡仍保持膜的完整性。随着培养时间延长，出泡细胞增加，细胞体积变小，部分细胞裂解。对照组细胞一直无形态学变化。Giemsa染色可见核膜裂解，染色质呈紫红色或蓝紫色，分割成块状，浓缩、靠近核膜，呈边集现象，并有典型的凋亡小体形成。对照组细胞一直保持大小一致，胞内染色质呈紫红色或蓝紫色，分布均匀。

　　2.2  电泳结果

　　实验组8、16、24 h DNA电泳均可见到明显的梯形条带，将NMDP浓度递减为0.005、0.001 g/L，仍可见到梯形条带。见图1。

　　图1  尼莫地平诱导HL60细胞DNA电泳图（略）

　　①DNA Marker；②对照组；③NMDP （8 h)；④NMDP (16 h)；⑤NMDP (24 h)；⑥NMDP (0.001 g/L,8 h)；⑦NMDP (0.001 g/L,24 h)；⑧NMDP (0.005 g/L,8 h)

　　2.3  细胞凋亡情况

　　NMDP诱导的细胞凋亡率随培养时间的延长而增加（F=267.34,q=9.12~25.43,P<0.01）。自8 h起与对照组比较差异有显著性（t=15.06~20.75,P<0.01）。见表1。

　　2.4  凋亡相关基因bcl2和bax的蛋白表达

　　2.4.1  Bcl2蛋白表达  在对照组呈深棕黄色。而在实验组随着时间延长，颜色逐渐变淡，24 h呈浅黄色。Bcl2蛋白表达的吸光度值在实验组随培养时间延长逐渐下降(F=43.21,q=2.57~16.25,P<0.05)。16、24 h与同期对照组比较，差异有统计学意义（t=3.66、5.62,P<0.05）。见表2。

　　2.4.2  Bax蛋白表达  在对照组呈浅黄色。而在实验组随着时间延长，颜色逐渐变深，24 h呈棕黄色。Bax蛋白表达的吸光度值在实验组随培养时间延长而逐渐增加(F=69.43,q=2.10~31.06,P<0.01)，与同期对照组比较，16、24 h有显著性差异(t=4.13、7.55,P<0.05、0.01)。见表3。

　　2.4.3  Bcl2/Bax值  在实验组，随时间延长，其比值逐渐下降(F=71.66,q=9.54~47.18，P<0.01)。与同期对照组比较，8、16 h差异有显著性(t=5.32、5.50,P<0.05)，24 h差异有极显著性(t=7.76,P<0.01)。见表4。

　　表1  不同时间点HL60细胞凋亡率（略）

　　与对照组比较,#t=15.06~20.75,P<0.01

　　表2  HL60细胞Bcl2蛋白的表达（略）

　　与同期对照组比较，#t=3.66、5.62，P<0.05
　
　　表3  HL60细胞Bax蛋白的表达（略）

　　与同期对照组比较，#t=4.13，P<0.05;*t=7.55，P<0.01

　　表4  HL60细胞Bcl2／Bax值（略）

　　与同期对照组比较，#t=5.32、5.50,P<0.05；*t=7.76，P<0.01

　　3  讨论

　　自1981年TSUROU等［4］首次报道异搏定逆转肿瘤细胞的MDR以来，许多学者对钙通道阻滞剂（CCB）的种类、逆转MDR强度、疗效作了大量的研究后认为，CCB逆转MDR的机制与钙离子通道拮抗活性有关，由于这些CCB种类各不相同，故与它们的结构没有密切关系。近年来的研究认为，CCB逆转耐药是通过竞争性结合肿瘤细胞膜Pgp特殊位点，从而增加了细胞内化疗药物的蓄积量而产生化疗增效作用的［5］；也有研究表明其作用是通过诱导细胞凋亡来实现的［6］。本研究结果表明，自加入NMDP后8 h起，HL60细胞逐渐出现典型的凋亡形态学改变，并出现DNA降解，琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡带，表明HL60细胞确已发生了凋亡，说明NMDP可诱导HL60细胞的凋亡。

　　细胞内的Ca2+不仅参与平滑肌的收缩，而且可作为第二信使参与多种生理和病理过程，在细胞的生命活动中起着重要的作用。NMDP可阻断细胞膜上的Ca2+通道，引发Ca2+稳态破坏，最终诱导细胞凋亡［7］。凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的作用发生在凋亡通路的晚期，作用相反，二者自身可形成同源二聚体，也可形成异源二聚体，当Bcl2蛋白以同源二聚体的形式存在时，细胞趋向于存活；但当Bax蛋白大量表达自身形成同源二聚体，或与Bcl2蛋白形成异源二聚体达50%时，则细胞对死亡信号敏感增强，凋亡加速而趋向于死亡，因而认为两种蛋白的表达程度决定了细胞的命运。本研究显示，HL60细胞为Bcl2高表达、Bax低表达细胞，在实验组随培养时间延长，Bcl2的蛋白表达下降，Bax表达升高，Bcl2/Bax比值下降。提示bcl2、bax不仅是一对与细胞凋亡密切相关的、反向表达的基因，而且其反方向表达增强可能是NMDP诱导HL60细胞凋亡的一个重要原因。NMDP在诱导HL60细胞凋亡过程中如何影响Ca2+的稳态破坏，是否有其他因素参与有待于进一步研究。

　　［参考文献］

　　［1］NOOTER K, SONNEVELD P. Clinical relevance of Pglycoprotein expression in haematological malignancies［J］. Leuk Res, 1994, 18: 233.

　　［2］孙立荣，庞秀英，卢愿，等．尼莫地平对儿童急性非淋巴细胞性白血病化疗增效的研究［J］．中华儿科杂志，2002，40(4)：240.

　　［3］孙立荣，刘艳明，庞秀英，等．尼膜地平对阿糖胞苷诱导的HL60细胞凋亡影响的研究［J］．中华儿科杂志，2002，40(6)：362.

　　［4］TSUROU T, LIDA H, TSUKAGOSHI S, et al. Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamel ［J］. Cancer Res, 1981, 41: 1976.

　　［5］DALTON T, DEUCHER K L, HOUTON K K, et al. Drugresistance in multiple myeloma and nonHodikins lymphoma detention of Pglycoprotein and potential circumvention by addition of rerapamil to chemotherapy［J］. J Clin Oncol, 1989,7:45.

　　［6］KONDA S, YIN D, MORIMURA T, et al. Combination therapy with cisplatin and nifedipine induces apoptosis in cisplatinsensitive and cisplatinresistant human glioblastoma cells［J］. Br J Cancer， 1995, 71: 282.

　　［7］TRUMP B F, BEREZESKY I K. The role of altered ［Ca2+］i regulation in apoptosis, oncosis, and necrosis［J］. Biochem Biophys Acta, 1996,1313: 173.

　　（本文编辑  黄建乡）

　　（青岛海慈医疗集团儿科,山东 青岛  266033; 青岛大学医学院附属医院儿内科）