冬凌草甲素对HL60细胞凋亡及Survivin表达的影响

【摘要】  目的 探讨冬凌草甲素对人白血病细胞株 HL60 细胞生长抑制作用及其机制。方法 收集经不同浓度冬凌草甲素干预的HL60细胞，制成细胞涂片,光学显微镜下观察细胞形态。采用MTT比色法观察不同浓度冬凌草甲素对HL60细胞增殖的抑制作用，通过凋亡试剂盒Annexin VFITC标记，流式细胞仪检测细胞凋亡率，并以RTPCR检测凋亡抑制基因 Survivin的表达。结果 冬凌草甲素在10～25 μmol/L范围内可抑制HL60细胞的生长，且呈时间和浓度依赖性。并可诱导HL60细胞发生凋亡，表现出特异性的凋亡形态学改变。流式细胞仪分析显示，冬凌草甲素处理后凋亡细胞比例增多,且随着药物浓度的增加而逐渐增加。RTPCR检测结果显示, 20 μmol/L冬凌草甲素作用后，与对照组相比， HL60细胞Survivin mRNA水平下降，且随时间延长表现得更为明显。结论 冬凌草甲素能抑制人白血病细胞株HL60细胞的生长增殖，并可诱导其发生凋亡， 其作用机制可能与凋亡抑制基因Survivin的下调有关。

【关键词】  L60 细胞；冬凌草甲素；细胞凋亡；Survivin

Effects of rebescensine A on HL60 cell apoptosis and expression of Survivin

    ZHAO Guoying1  ZHAO Mingfeng2  GUO Jinjiang1  et al

    1 Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603;

    2 Department of Pathology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

    【Abstract】  Objective  To investigate the antiproliferation effect of rebescensine A on leukemia HL60 cells and its mechanism.Methods  HL60 cells in culture medium in vitro were given different concentrations of rebescensine A. Morphological changes were observed in cell smears. MTT assay was used to observe the growth inhibition of HL60 cells; Annexin VFITC and flow cytometry were used to examine cell apoptosis rate.RTPCR was used to observe the expression of Survivin.Results  Rebescensine A (1025 μmo1/L) could inhibit the growth of HL60 cells and induce apoptosis significantly in a time and dosedependent manner. Marked morphological changes of cell apoptosis were observed. Apoptotic cell count increased along with increasing concentrations of rebescensine A. The downregulated expression of Survivin mRNA was showed by RTPCR and changed more obviously with prolongation in HL60 cells treated by rebescensine A 20 μmol/L.Conclusion  Rebescensine A could inhibit  proliferation and induce  apoptosis of HL60 cells in vitro.One of the mechanisms may be the downregulated expression of survivin mRNA.

    【Key words】  HL60 cells,rebescensine A,apoptosis,Survivin

    白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，近年来其疗效有很大提高，但仍有部分患儿对化疗不敏感和耐药，寻找新型治疗白血病的药物成为临床研究热点之一。研究表明，冬凌草甲素具有广泛的抗肿瘤作用，并对白血病细胞生长具有明显抑制作用［1～3］，其机制与促进细胞凋亡有关，但其诱导白血病细胞凋亡的相关机制目前尚未明确。研究冬凌草甲素对白血病细胞的生长抑制作用及其对Survivin基因表达的影响，对进一步探索冬凌草甲素促进白血病细胞凋亡相关机制具有重要意义。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  人白血病细胞株HL60细胞为山东大学血液病中心实验室冻存。冬凌草甲素购自上海卓康生物科技有限公司，规格20 mg/支(C≥98%) ；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为AMRESCO产品；膜联蛋白V(Annexin V)凋亡检测试剂盒购于Biovision公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  细胞培养： HL60细胞株复苏后悬浮生长于RPMI 1640培养液中，内含10%小牛血清， 1 mmol/L谷胺酰胺及青、链霉素各100 U/L。于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养， 每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞接种于含冬凌草甲素浓度分别为5、10、15、20 、25 μmol/L的培养体系中进行实验,将细胞终浓度调至2×105/L。

    1.2.2  细胞形态学观察： 收集经不同浓度的冬凌草甲素分别诱导处理24、48和72 h的HL60细胞，离心洗涤，制成细胞涂片, 干燥后瑞氏姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态。观察细胞处理后细胞膜细胞质及细胞核的变化，尤其观察凋亡小体形成等。

    1.2.3  MTT 比色法检测细胞增殖抑制率:调取HL60细胞1.0×105/ml，接种于96孔培养板内，每孔100 μl，每组各设6个复孔，同时设调零孔（空白，培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。每组设定3复孔。加入冬凌草甲素使终浓度分别为5、10、15、20、25 μmol/L。置37 ℃、5%CO2温箱培养，分别诱导培养至24、48和72 h，于终止培养前4 h每孔加MTT（5 mg/ml）10 μl，继续孵育4 h。终止培养后,离心，吸去上清，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO），摇匀，置摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上波长490 nm处测各孔吸光值。用空白对照调零,计算出药物对细胞生长抑制率。根据公式细胞抑制率＝1-（ 试验组OD值－空白组OD值）/ （对照组OD值－空白孔OD值）×100%=(对照组值-实验组值)/对照组值×100%，分别求得各组的细胞抑制率。

    1.2.4  流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集不同浓度冬凌草甲素作用72 h后的HL60细胞，分别制备成0.5 ml PBS单细胞悬液,先后加入凋亡试剂盒中Annexin VFITC和PI各5 μl,室温下避光染色10 min,上流式细胞仪检测,软件分析结果，未加药组为对照组。

    1.2.5  RTPCR检测Survivin mRNA的表达:收集对照组和药物作用组 （冬凌草甲素20 μmol/L作用48 h）细胞，Trizol裂解（GIBCO公司）提取细胞总RNA，特定蛋白分析仪测定RNA纯度（A260/A280＞1.75）。加入随机引物及 MMuLV逆转录酶（MBI，FERMENTAS）合成cDAN链。取cDAN 0.1 μg，加入 10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 pmol/μl 的上下游引物各0.5 μl，TaqDAN聚合酶（Promega，5 U/μl）0.5 μl，灭菌双蒸水将反应体系补足至25 μl。ThermoPX2型PCR仪进行扩增，以βactin作为内参照。Survivin反应条件为： 预变性95 ℃ 2 min,94 ℃变性45 s，61 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min， 35个循环，最后延伸10 min。βactin反应条件为：预变性95 ℃ 2 min；变性94 ℃ 45 s，退火58 ℃1 min，延伸72 ℃1 min；最后延伸10 min，共35个循环。

    各引物序列分别为：Survivin上游引物：5'CTTTCTCAAGGACCACCGCATC3',下游引物：5'CAATCCATGGCAGCCAGCTGC3'，目的基因393 bp。βactin上游引物为：5'CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3',下游引物为5'GTCACGCACGATTTCCCGCT3'，扩增产物为 619 bp。扩增产物行1.7%琼脂糖凝胶电泳,于BIORAD Gel 2000凝胶成像仪上成像Quantity One软件作半定量分析。

    1.3  统计学分析  所得数据经SPSS 10.0 for windows软件处理,结果用x±s表示。数据用t检验进行统计学分析,P＜0.05表示有统计学意义。

    2  结果

    2.1  细胞形态学变化  空白对照组的HL60细胞光镜下细胞呈圆形，胞核居中占整个细胞绝大部分，染色质呈紫红色，胞浆量少； 10 μmol/L及其以上浓度的冬凌草甲素处理的HL60细胞形态有明显改变，甚至出现凋亡小体。以20 μmol/L的冬凌草甲素处理细胞48 h后,大部分细胞出现凋亡的形态学变化。表现为细胞皱缩、体积缩小,多数细胞染色质浓集、细胞核固缩,细胞内出现典型的凋亡小体,表现出现特异性的凋亡形态。

    2.2  冬凌草甲素对HL60细胞的生长抑制作用  5 μmol/L的冬凌草甲素对细胞的生长抑制作用不明显，无统计学意义；在10 ～25 μmol/L浓度范围内,随作用时间的延长，细胞生长抑制率逐渐增加,20 μmol/L的冬凌草甲素作用48 h后细胞的生长基本被抑制；细胞的生长抑制率与药物浓度有明显的依赖关系， 随着药物浓度时间增加， 生长抑制率增加，具体数据见表1。

    表1  不同浓度冬凌草甲素处理HL60细胞不同

    时间的生长抑制率

    组  别

    (μmol/L)不同作用时间的生长抑制率（%）12 h24 h36 h48 h109.85±1.1218.57±3.3124.73±2.5829.77±2.341516.32±2.1540.57±2.2745.34±4.4349.67±5.412028.79±1.2158.96±5.3576.51±3.3784.15±2.192544.21±5.2381.13±6.2887.91±8.2491.08±8.392.3  冬凌草甲素对HL60细胞凋亡的影响  先后用膜联蛋白VFITC及流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图。冬凌草甲素处理后, II、IV象限的细胞数比例增多,且随着药物浓度的增加而逐渐增加,以IV象限尤其明显（见表2）。

    表2  不同浓度冬凌草甲素对HL60细胞的Annexin V检测组别

    (μmol·L-1) Annexin V（%）Ⅰ象限Ⅱ象限Ⅲ象限Ⅳ象限对照2.25±0.561.45±0.4795.32±8.490.98±0.25102.18±0.601.75±0.5990.46±9.235.16±0.53152.52±0.822.16±0.6380.00±5.4715.32±1.09﹡202.75±0.952.45±0.8965.67±7.4829.13±1.45﹡253.28±1.185.13±1.3558.37±7.1633.22±1.59﹡    注：﹡与对照组相比P＜0.05

    2.4  冬凌草甲素对HL60细胞Survivin基因mRNA表达的影响  RTPCR结果显示,与对照组相比，冬凌草甲素作用后，HL60细胞Survivin mRNA水平下降，随时间延长表现得更为明显。

    3  讨论

    细胞凋亡受抑在白血病的发病中起非常重要的作用，故诱导凋亡疗法是消灭白血病细胞的一条新途径。近年来中药治疗急性白血病有很大的进展，许多植物成分在体外有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但临床应用尚在研究中。

    冬凌草甲素(rebescensine A)是从冬凌草中进一步提取出来的一种四环二萜类化合物。其活性成分及药理作用机制比较复杂，总结文献资料［3～5］其抗癌作用机制可能与以下因素有关： ①抗突变作用，②降低肿瘤细胞的钠泵转运活性，③增强其他抗肿瘤药物的疗效。既往研究资料显示冬凌草甲素对急性白血病HL60细胞具有明显的生长抑制作用,经冬凌草甲素处理后的HL60细胞,其端粒酶活性下降,bcl2表达水平下调,部分细胞出现凋亡现象。［2］我们研究也证实了冬凌草甲素对HL60细胞的生长抑制作用，并且在10～25 μmol/L范围内的冬凌草甲素对HL60细胞生长抑制作用有浓度时间依赖性。20 μmol/L的冬凌草甲素处理细胞48 h后,大部分细胞出现凋亡的形态学变化。通过膜联蛋白VFITC及流式细胞仪分析发现，在相同作用时间下，HL60细胞凋亡率随药物作用剂量的增高而升高。

    Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的一个新成员, 1997年由Ambrosini等用效应细胞蛋白酶受体1(EPR1) cDAN在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来［5］。研究表明,Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子［4］,既直接作用于级联反应的最终效应蛋白Caspase3和Caspase7,也可通过P21间接抑制Caspase［6］,从而阻断细胞的凋亡过程。Survivin基因是一种抗凋亡基因，它不仅具有抑制细胞凋亡的功能,而且参与了细胞增殖分化的调控, Ikehara等［7］认为,Survivin与肿瘤的浸润、转移及治疗和预后有关。Survivin基因的组织表达分布具有高度的选择性［8］，在实体瘤中的研究发现，高水平的Survivin基因的表达能够预测肿瘤进展和无病生存期，提示预后相关信息［9］。所以Survivin可以作为某些肿瘤（包括癌前病变）的筛选和诊断指标之一，并且可以作为一个独立的肿瘤预后指标。

    在我们的实验研究中表明，冬凌草甲素作用后，HL60细胞Survivin mRNA水平下降，随时间延长表现得更为明显。与国内外的研究相一致。本研究揭示，冬凌草甲素在诱导HL60细胞凋亡的过程中伴有Survivin基因下调，表明该基因参与冬凌草甲素诱导HL60的细胞凋亡， 并提示冬凌草甲素的凋亡诱导作用可能部分通过Survivin途径实现。我们的研究结果表明，冬凌草甲素是一种潜在的白血病治疗药物，这些资料为进一步进行临床前的动物实验以及冬凌草甲素广泛应用于临床提供了更有力的理论及实验依据。

【参考文献】
  ［1］ 吴孔明,张覃沐,王庆瑞,等.冬凌草甲素对肿瘤细胞钠泵活性的影响［J］.肿瘤防治研究，1994,21（3）:208209.

［2］ 申家英, 杨波.冬凌草甲素对HL60细胞的生长抑制作用及其对细胞端粒酶活性的调节［J］.白血病·淋巴瘤,2003,12(4)：224226.

［3］ 杨胜利，韩绍印，张巧，等．冬凌草甲素抗突变性研究［J］.癌变·畸变·突变，2001,13(1): 810.

［4］ Suzuki A, Ito T, Kawano H,et al.Survivin initiates procaspase3/P21 complex fomation as a result of interaction with CDK4 to resist Fasm idiated cell death［Ｊ］.Oncogene，2000，19( 10): 13461353.

［5］ Adida C, Haioun C, Salles G,et al. Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B cell lymphomas［J］.Blood,2009，6(5):19211925.

［6］ 杨胜利，张巧，宋爱去，等.冬凌草甲素对大鼠肺及肝原代细胞非程序ＤＮＡ 合成的影响［J］.河南医科大学学报，2001,36(4):415418.

［7］ Ikehara M, Oshita F, Kaneda Y,et al. Expression of survivin correlated with vessel invasion is a marker of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung［Ｊ］.Oncol Rep, 2002, 9(4): 835838.

［8］ Sarela AI, Macadam R CA, Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death from ecurrent colorect carcinoma［J］.Gut, 2000,46(5): 645650.

［9］ Islam A, Kageyama H, Takada N, et al.High expression of survivin, mapped to 17q25, is significantly associated with poor prognostic factors and promotes cell survival in human neuroblastoma［J］. Oncogene, 2000, 19(5): 617623.

(收稿日期：20081203)

作者单位：1 滨州医学院附属医院儿科 滨州市 256603；2 滨州医学院附属医院病理科