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［摘要］目的 观察牛磺酸和支链氨基酸混合物（T&B）对四氯化碳（CCl4）致肝纤维化模型大鼠肝组织胶原 代谢的影响。方法实验分为对照组、模型组和T&B不同剂量（0.5、1.0、2.0 g/kg体质量）组。用体积分数0.6的CCl4橄榄油溶液3 mL/kg体质量背部皮下注射，每周2次，共12周，制备大鼠肝纤维化模型。6周后，T&B组分别灌胃给予T&B 0.5、1.0、2.0 g/kg体质量，对照组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水，每日1次，共6周。测定肝功能指标:谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性，清蛋白（Abl）含量;肝纤维化指标:透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、羟脯氨酸（Hyp）含量，并观察大鼠肝组织的病理变化。结果与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST活性升高，Hyp、HA、LN含量升高，Abl含量降低，差异均有显著性（ F=3.505～35.719，q=5.010～20.531 ，P <0.01）。与模型组比较，T&B 1.0、2.0 g/kg体质量组大鼠血清ALT、AST活性降低，Hyp、HA、LN的含量降低，Abl含量增加，差异有显著性（q=2.875～7.111，P <0.05、0.01）;肝组织学检查显示细胞外基质（ECM）沉积减少，肝纤维化程度减轻。结论 T&B能够通过保护肝细胞功能，调节胶原代谢，维持ECM代谢平衡，抑制肝纤维化的发生和发展。
［关键词］牛磺酸;氨基酸类;肝硬化;胶原;大鼠，Wistar
EFFECT OF TAURINE AND BRANCHED CHAIN AMINO ACID ON METABOLISM OF COLLAGEN OF RAT HEPATOFIBROSIS MODEL
SONG YING， JIN YI，WANG DONG， et al
（Department of Pathology， Qingdao University Medical College， Qing-dao 266021， China）
［ABSTRACT］ Objective To study the effect of taurine and branched chain amino acid （T&B） on the collagen metabolism of rat hepatofibrosis model. Methods Experimental rats were divided into control， model， T&B 0.5，1.0，2.0 g/kg groups and injected subcutaneously with 60% carbon tetrachloride （CCl4）3 mL/kg body weight twice a week except those in control group. After 6 weeks， the rats in T&B group were fed with a compound commixed with taurine and branched chain amino acid in the opti- mal proportion everyday until the end of the 12 th week and those in the control and model groups were fed by normal saline. ALT，AST， HA， LN， and Hyp were determined to show the hepatocellular function and the degree of hepatofibrosis. The pathological conditions of liver tissue were observed. Results The activity of transaminase， the content of Alb，Hyp， HA， and LN in the model group were much higher than those of the control group （ F=3.505-35.719，q=5.010-20.531，P <0.01）. T&B 1.0 or2.0 g/kg reduced the activity of transaminase， increased the content of Alb （ F=3.505-13.720;q=2.875-5.010;P <0.05，0.01 ）. Significant difference was noted in the content of Hyp， HA and LN between the T&B 1.0 or 2.0 g/kg group and the model group （ F=13.212-35.719;q=4.264-7.111;P <0.05，0.01）. T&B also inhibited the accumulation of ECM and alleviated the degree of hepatofibrosis in pathologic examination. Conclusion Compound taurine can resist hepatofibrosis by protecting the function of hepatocytes， regulating the collagen metabolism and keeping the balance of ECM.
［KEY WORDS］taurine; amino acids; liver cirrhosis; collagen; rats， Wistar
肝纤维化（HF）是诸多慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，其病理特征是以胶原为主的细胞外间 质（ECM）在肝间质内的过量沉积。研究结果表明，牛磺酸（Tau）可以保护肝细胞功能［1］。而支链氨基酸（BCAA）是人体必需氨基酸，已广泛用于肝性脑病的预防和治疗，但其对HF的作用未见报道。本研究将Tau和BCAA按一定比例混合形成复合物（T&B），旨在探讨其对HF模型大鼠肝组织胶原代谢的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
牛磺酸购自上海生物化学试剂公司（批号: 98402）。L-亮氨酸（Leu）、L-缬氨酸（Val）、L-异亮 氨酸（Ile）购自上海蓝季科技发展有限公司（批号: 990901）。四氯化碳（CCl4）购自宜兴市第二化学试剂厂。橄榄油购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、清蛋 白（Alb）试剂盒购自北京中生生物工程高科技公司。羟脯氨酸（Hyp）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸 （HA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 动物及分组
体质量120～150 g的Wistar大鼠80只，雌雄各半，由山东医科大学动物中心提供。标准饲料喂养，自由饮水。将大鼠随机分成5组:对照组（Ⅰ组），11只;模型组（Ⅱ组），27只;T&B 0.5、1.0、2.0 g/ kg体质量组（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组），各14只。
1.3 动物模型制备与用药
除Ⅰ组以外，其余各组大鼠给予体积分数0.6 的CCl4橄榄油溶液背部皮下注射（3 mL/kg体质量），每周2次，共12周。第2周始，每周随机处死Ⅱ组大鼠2只，观察肝组织病变程度。6周后，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组分别灌胃给予T&B 0.5、1.0、2.0 g/kg体质量，Ⅰ组和Ⅱ组灌胃给予等体积的生理盐水，每日1次，共6周。各组动物在最后一次注射CCl4 后48 h处死 。腹主动脉取血，分离血清，-20 ℃保存。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 肝功能测定
用SCO-Ⅱ半自动生化分析仪测定血清ALT、AST活性和Alb含量。
1.4.2 血清LN、HA含量测定 用放免分析法。
1.4.3 Hyp含量测定
用SCO-Ⅱ半自动生化分析仪测定血清Hyp含量。另取部分肝组织制成体积分数0.10的肝组织匀浆，按试剂盒说明用722光 栅分光光度计测定肝组织匀浆中Hyp的含量。
1.4.4 肝脏组织学检查取肝大叶中部肝组织，以 40 g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察肝纤维化程度。
1.5 统计学处理
计量资料用 x±s 表示，组间比较用 F 检验。用SPSS统计软件进行统计学处理。
2 结 果
2.1 T&B对肝纤维化模型大鼠肝功能的影响
与Ⅰ组比较，Ⅱ组大鼠血清ALT、AST活性明 显升高，Alb含量明显降低，差异均有显著意义 （F=3.505～13.720，q=9.861～20.531，P < 0.01 ）。Ⅳ、Ⅴ组ALT、AST活性与Ⅱ组比较明显 降低，差异有显著性（ q=3.001～4.171，P <0.05）。Ⅲ～Ⅴ组Alb含量与Ⅱ组比较明显增加，差异有显著性（q= 2.875～5.010，P <0.05、0.01）。见表1。表1 各组大鼠肝功能指标的测定结果（略）
2.2 T&B对大鼠血清内HF指标的影响
Ⅱ组大鼠血清HA、LN含量与Ⅰ组比较明显升高，差异有显著性（F=18.736、13.212，q=7.830、5.121，P <0.01）。Ⅳ、Ⅴ组HA、LN含量与Ⅱ组比较明显降低，差异有显著性（ q=4.807～7.111，P<0.01）。见表2。表2 各组大鼠血清HA、LN含量比较（略）
2.3 T&B对大鼠血清及肝组织匀浆中Hyp含量的影响 Ⅱ组大鼠血清及肝组织匀浆Hyp含量与Ⅰ组比较均升高，差异有显著意义（ F=35.719、16.253，q= 5.540、6.500，P <0.01）。Ⅳ、Ⅴ组Hyp含量与Ⅱ组比较明显降低，差异均有显著意义（ q=4.264～7.002 ，P <0.05、0.01）。见表3。表3 各组大鼠血清及肝组织匀浆中Hyp含量比较（略）
2.4 肝脏组织学检查
Ⅰ组大鼠肝小叶结构完整，小叶之间的汇管区 有少量纤维组织。Ⅱ组大鼠肝组织肝小叶结构严重破坏，自汇管区向肝实质内延伸的纤维组织形成纤维间隔分割包绕肝小叶，形成假小叶。Ⅳ、Ⅴ大鼠组肝组织病变程度较轻，肝小叶结构尚清晰，汇管区扩大，纤细的纤维组织沿小叶间延伸，未形成完整的假 小叶。
3 讨 论
HF是多种慢性肝病向肝硬化进展的必经阶段，抑制或逆转HF对减少肝硬化、肝癌发病率具有重要意义。然而，目前临床上仍没有理想的方法治 疗HF。Tau是体内一种含量丰富的含硫氨基酸，具有稳定细胞膜、促进外源性化合物的生物代谢等多种 生物学作用［2，3］。研究显示，Tau对不同原因造成的肝细胞损伤均有保护作用［2，4～6］。BCAA是人体的 必需氨基酸，包括Leu、Ile、Val，它们主要存在于骨骼肌和肾脏等肝外组织，通过转氨基和氧化作用提供机体能量，并具有维持膜稳定及抗氧化作用［7，8］。富含BCAA的复合氨基酸液已广泛用于临床治疗重度肝病肝昏迷，调节血浆支链氨基酸与芳香族氨基酸的比例，平衡脑内的兴奋性和抑制性神经递质。本研究用T&B喂养肝纤维化模型大鼠，结果显示，大鼠血清ALT、AST活性降低，血清Alb含量增加，A/G比例失调得到纠正，肝细胞功能明显改善，尤以Ⅳ、Ⅴ组效果更明显。其结果一方面消除了使 枯否细胞、贮脂细胞激活的刺激因素，避免HF的启动;另一方面能避免肝细胞坏死所致的网状支架的 塌陷及肝实质内纤维间隔的形成和延伸。胶原是一种纤维状的糖蛋白，含有其他蛋白质 中少见的Hyp，且胶原中脯氨酸和Hyp的量约占氨 基酸残基总数的1/4。可以认为，Hyp是胶原特有的氨基酸，它对维持胶原分子的稳定性具有重要作用。在本研究中，Ⅱ组大鼠肝组织匀浆中Hyp含量 增加，Ⅳ、Ⅴ组肝组织匀浆中Hyp含量较Ⅱ组明显减少。说明纤维化过程中，肝组织胶原含量增加，而应用T&B 1.0、2.0 g/kg 6周后胶原沉积减少。血 清中Hyp的含量测定结果显示，Ⅱ组Hyp含量较 Ⅰ组亦有增加。由于血清中的Hyp含量反映体内胶原代谢，特别是分解代谢的水平，因而，HF过程中胶原分解代谢亦增强。可见，胶原代谢的失衡是HF形成的内在原因，胶原的合成与分解作用均增 强且合成量大于降解量，肝组织中的胶原沉积逐渐增多，形成HF。因此，胶原合成代谢增强是HF形成的重要原因，而调节胶原代谢，减少胶原沉积是 T&B抗HF的可能机制。 胶原是一种代谢很不活跃的物质，脯氨酰羟化 酶（PH）、胶原酶（CL）及血浆脯肽酶（PLD）分别是 胶原合成和分解代谢的关键酶。有实验对博莱霉素 所致大鼠肺纤维化模型研究显示，Tau能有效抑制PH的活性［9］。因而，T&B可能通过调节胶原代谢关键酶的含量和活性，维持肝组织胶原代谢的平衡，减少胶原在肝间质的沉积，从而抑制HF的进展。HA、LN是非胶原性ECM的重要成分。HA及其他蛋白多糖共同构成蛋白聚糖聚合体，并能促 进胶原分子的聚合。电镜观察证实，LN与Ⅳ型胶 原有特异性结合点，能与多种基质成分交联，并能自 身交联，从而连接基质中的多种大分子成分，形成稳 定的ECM。本实验采用放射免疫分析法研究显示，T&B亦可降低血清HA、LN含量。提示T&B可通过减少非胶原性ECM的含量，抑制它们与胶原的相互作用，破坏ECM的稳定性，从而抑制HF的 进展。
综上所述，T&B能够抑制HF的发生和发展，其作用可能是通过保护肝细胞功能，调节胶原代谢， 维持ECM代谢平衡实现的。
［参考文献］
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［5］王红，胡晓明，冯艳青，等. 牛磺酸对半乳糖胺及硫酸亚铁-抗 坏血酸所致大鼠肝细胞损伤的保护作用［J］. 中国药理学与毒 理学杂志，1993，7:282.
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［9］WANG Q， GIRI S N， HYDE D M， et al. Amelioration of bleomy- cin-induced pulmonary fibrosis in hamxters by com- bined treatment with taurine and niacin ［J］. Biochem Pharma- col， 1991，42:1115.
1 青岛大学医学院病理学教研室，山东 青岛 266021;
2 青岛大学医学院生理学教研室;
3 青岛国风药业集团;
4 山东大学医学院病理学教研室