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［摘要］目的 观察饱和脂肪酸对大鼠主动脉MMP-9及PPARα表达的影响及非诺贝特对其的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠30只，随机分为对照组、高脂组（HF组）、高脂加非诺贝特组（HF+FF组）。分组喂养20 周后，采用RT-PCR方法测定大鼠主动脉MMP-9和PPARα的mRNA水平;采用Western blot方法测定大鼠主动 脉MMP-9和PPARα蛋白表达水平。 结果 HF组大鼠主动脉MMP-9 mRNA及其蛋白水平均明显高于对照组（t= 4.65、5.48 ，P<0.01）;PPARα mRNA及其蛋白水平则低于对照组（t=2.52、2.98，P<0.05）。HF+FF组PPARα mRNA及其蛋白水平明显高于HF组（t=4.51、6.29，P<0.01），而MMP-9 mRNA及其蛋白水平则明显 低于HF组（t= 5.62、5.97，P <0.01）。结论 非诺贝特可上调PPARα表达，下调MMP-9水平，从而对动脉粥样硬化的发生和发展可能起到保护作用。
［关键词］明胶酶B;过氧化酶体激增剂;动脉硬化;非诺贝特
INFLUENCE OF FENOFIBRATE ON THE EXPRESSION OF MMP-9 AND PPARα OF THE RAT AORTA
ZHU QING， KANG WEI-QIANG， WANG XI-NING
（Department of Cardiology， Hiser Hospital of Qingdao， Qingdao 266033， China）
［ABSTRACT］ Objective To study the effect of high-fat diet on the expression of MMP-9 and PPARα in the rat aorta and the protective effect of Fenofibrate. Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into control group， high-fat diet group （HF） and Fenofibrate-treated group （HF + FF）. Fenofibrate was administrated orally for 20 weeks， plasma triglyceride and cho-lesterol levels were measured. Protein levels and mRNA levels of MMP-9 and PPARα of rat aorta were determined using Western blot and RT-PCR. Results In HF group， both the mRNA and its protein levels of MMP-9 in rat aorta were higher than that in the control group （t= 4.65，5.48; P <0.05），while the expression of PPARαand its protein were lower （t= 2.52，2.98; P <0.05 ）. In HF+FF group， the expression of PPARα mRNA and its protein increased compared with HF group （t= 4.51，6.29; P < 0.01），while MMP-9 mRNA and its protein decreased （t= 5.62，5.97; P<0.01）. Conclusion Fenofibrate may up-regu-late the expression of PPARα and down-regulate that of MMP-9，thus to play a role in the protection of the occurrence and develop- ment of atherosclerosis.
［KEY WORDS］gelatinases B; peroxisome proliferators; arteriosclerosis; Fenofibrate
在目前冠心病的基础与临床研究中，高脂血症等危险因素与冠状动脉内粥样斑块形成的相互关系已经得到广泛证实和认同。大量研究结果显示，IL、hs-CRP、MMP-9等炎性因子及Apo基因多态性表达在动脉粥样硬化（AS）过程中起到了重要的作用，并与高脂血症等危险因素有着某种相关性。基于此，在众多的血液和组织因子中，寻找一个与动脉粥 样硬化斑块及其危险因素均具有较高敏感性和特异性的相关因子，成为目前冠心病研究工作中的新热点。本项实验研究即以此为出发点，探讨在高脂饮食诱发动脉粥样斑块的过程中，非诺贝特对MMP-9及PPARα表达的影响，以及MMP-9与动脉粥样斑块形成可能的相关性。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠30只，体质量180～200 g，由山东省卫生防疫站提供。大鼠由专人单笼饲养，明 暗周期为12 h，自由饮水，房间温度保持在（25±1）℃，湿度在50%左右。适应性饲养1周，随机将大鼠分为对照组、高脂组（HF组）和高脂加非诺贝特组（HF+FF组），每组10只。
1.2 药品和试剂
大鼠饲料购自山东华康饲料公司。PPARα激活剂非诺贝特购自山东医药公司。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物技术有限公司;组织蛋白裂解液、MMP-9和PPARα一抗及相应二抗均购自Santa-Cruz公司;蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad公司;β-actin一抗购自Ambion公司。
1.3 饲养方法
对照组大鼠食用标准饲料;HF组给予高脂饮食，脂肪热量占59%，以饱和脂肪酸为主;HF+FF组在HF组基础上加用非诺贝特（20 mg·kg-1·d-1）。各组大鼠每日膳食热量控制在每只310 kJ ，每天9:00定时灌胃，喂养5个月。然后抽血处死大鼠，取主动脉冻存。
1.4 RT-PCR
采用Trizol法抽提大鼠主动脉总RNA，RT- PCR反应依据TaKaRa-RNAPCRkit说明进行。 PCR反应扩增MMP-9和PPARα所用引物如下。
20 μL逆转录体系中加入RNA 1 μg。紫外线分光光度仪（DU640） 测定RNA量和纯度。其中GAPDH为内参照。 RT-PCR反应体系50 μL，扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶影像分析仪（Al- phaimager 2200）测定各条带的吸光度值，计算各目 的条带与内参照的比值。
1.5 血脂的测定
血三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）含量分别采用GPO-PAP乙酰丙酮法和CHO-PAP法测定。
1.6 Western blot
液氮冻存的主动脉剪碎，加入预冷的TBS洗涤 2次，按1∶10比例加入预冷的裂解液，超声仪裂解组织10 s，4 ℃静置30 min使其充分裂解;4 ℃下12 000 r/ min离心10 min，取上清，改良Lowry法测定胞浆蛋白浓度;核蛋白提取按照Pierce公司试 剂盒说明进行。3×Loading Buffer稀释各样品蛋白，60 ℃下变性30 min，上样10 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭过夜后，分别加入PPARα和MMP-9一抗4 ℃振荡过夜，TBS/T冲洗5 min，共3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗常温振荡孵育1 h，TBS/T冲洗5 min，共3次，ECL法显影，凝胶影像分析仪测定蛋白条带浓度后，计算各蛋白条带和内参照的比值。
1.7 统计学处理
数据用 x+s 表示，SPSS 10.0软件处理数据，组间比较采用 t 检验。
2 结 果
2.1 各组血脂测定结果
HF组大鼠血脂各项指标水平较对照组明显升高（t=3.69～9.32，P <0.05）;HF+FF组TC、HDL-C、LDL-C水平较HF组水平明显降低（t= 2.93～5.24，P<0.05）。表1 各组大鼠血脂测定结果（略）
3 讨 论
众所周知，高脂饮食可使血浆胆固醇和三酰甘油水平明显升高，是导致以动脉壁脂质蓄积为特征的AS改变的主要因素，而斑块纤维帽的稳定，取决于间质1型胶原这一主要支持分子，而MMP-9具 有溶解它的作用［1］。而且MMP-9不仅表达于单核细胞，而且表达于平滑肌细胞和泡沫细胞，表达率和强度尤以不稳定斑块为著［2］ 。此外，MMP-9还有分解1、2、3、4、6型胶原和弹性蛋白、粘连蛋白和、层蛋白的作用，并通过MMP-2、3、9加重基质的溶解作用，还能调节细胞因子IL-2、IL-8、TNF-1和T细胞膜蛋白CD2、CD4、CD8，从而加重炎症反应。作为脂质和脂蛋白代谢的调节物，PPARα可以 调控血浆胆固醇水平、促进脂肪细胞分化、影响巨噬 细胞内胆固醇内稳态、稳定AS斑块、抑制血小板聚集，从而影响AS的发生和发展［3］。另外，PPARa激动剂可抑制MMP-9的表达，这种PPARa依赖的抑制作 用可防止AS斑块的破裂及其导致的血栓形成［4］。PPARa的这两方面作用，可以解释上述高脂药物干预组大鼠MMP-9明显降低的原因。本项实验中，与对照组相比，HF组TC、LDL-C水平明显升高，HDL-C则显著下降，验证了高脂饮食可以导致高脂血症作用;同时，高脂组MMP-9表达增强，而PPARα表达相应减弱，提示高脂血症造成MMP-9表达增强，可能是通过对PPARα表达的抑制实现的。在HF组与HF+FF组的比较中，可以看出，PPARα激活剂可以显著增强PPARα表达 水平，而同时MMP-9水平明显下降，存在以下两方面可能原因:一是PPARα激活剂有效降低了血脂水平，进而抑制了MMP-9的表达;二是PPARα表 达增强，直接降低了AS斑块组织中MMP-9的表达水平［5，6］。本实验揭示了高脂饮食与大鼠主动脉MMP-9表达之间的相关性，并证实PPARα激活剂可以有 效降低血脂水平并抑制MMP-9表达，从而起到抑 制和稳定动脉内壁粥样斑块的作用。同时也可以看出，高脂血症状态及MMP-9表达增强，亦可明显抑 制PPARα的水平。两者间明确的相互作用机制，则有待进一步研究。随着对两者关系认识的不断深入，相信会对AS的药物干预产生积极的指导意义。
［参考文献］
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［6］于辛，邵晓光，谭兰，等. 载脂蛋白E基因多态性与脑梗死的关系［J］. 青岛大学医学院学报，2000，36（4）:265-267.
1 青岛市海慈医院心内科，山东 青岛 266033;
2 青岛市市立医院;
3 山东省立医院肾内科