HIF-1α、VEGF及IGF-Ⅰ蛋白在子宫内膜癌中的表达及其意义

　　［摘要］  目的 研究低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）及胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）蛋白在子宫内膜癌中的表达及其意义，并探讨HIF-1α与IGF-Ⅰ及VEGF蛋白表达之间的关系。  方法应用免疫组织化学PicTure TM方法检测HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在42例子宫内膜癌、10例子宫内膜不典型增生及20例正常子宫内膜组织中的表达情况，结合临床分期、病理分级进行分析。 结果 HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在  正常子宫内膜组织、子宫内膜不典型增生组织及子宫内膜癌组织中阳性表达率比较，差异有显著性（χ2=22.094～25.261，P <0.01）。HIF-1α蛋白在子宫内膜癌组织中的阳性表达率Ⅰ期为42.11%，Ⅱ期为81.82%，Ⅲ期为83.33% ，三者比较有显著性差异（ χ2=7.435，P <0.05）;HIF-1α蛋白的表达与病人发病年龄、病理分级无关（ χ2=  0.036、0.634，P >0.05）。VEGF蛋白在子宫内膜癌组织中阳性表达率Ⅰ期为36.84%，Ⅱ期为81.81%，Ⅲ期为  75.00%，三者比较差异有显著性（ χ2=6.578，P<0.05）;VEGF蛋白的表达与病人发病年龄、病理分级无关（χ2=1.879、0.097，P >0.05）。子宫内膜癌组织中IGF-Ⅰ蛋白阳性表达率与病人发病年龄、临床分期及病理分级无关（ χ2=0.190～0.791，P >0.05）。子宫内膜癌组织中HIF-1α与VEGF蛋白表达呈显著正相关（ r=0.469，P<0.01 ）;IGF-Ⅰ与VEGF蛋白的表达呈显著的正相关（ r=0.452，P<0.01）;HIF-1α与IGF-I蛋白的表达无相关性（r= 0.209，P >0.05）。结论 子宫内膜癌组织中HIF-1α、VEGF、IGF-I蛋白参与了子宫内膜癌的发生发展。子宫内膜癌组织中的HIF-1α、IGF-Ⅰ蛋白表达与VEGF呈正相关，IGF-Ⅰ蛋白与HIF-1α的表达无相关性，提示HIF-1α  与IGF-Ⅰ可能通过上调VEGF蛋白的表达，促进肿瘤的血管生成而促进子宫内膜癌的发生。   

　　［关键词］子宫内膜肿瘤;缺氧诱导因子-1α;血管内皮生长因子;胰岛素生长因子Ⅰ;免疫组织化学   

　　EXPRESSION OF HIF-1α， VEGF AND IGF-Ⅰ IN ENDOMETRIAL CARCINOMA AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE

　　GENG LEI， CUI ZHU-MEI， LI YU-JUN， et al  

　　（Department of Gynecology，Zibo Maternal and Child Care Hospital，Zibo 255029，China）  

　　［ABSTRACT］  Objective  To study the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha （ HIF-1α）， vascular endothelial   growth factor（VEGF）and insulin-like growth factor-Ⅰ （IGF-Ⅰ） in endometrial carcinoma and to investigate the relationship be-tween HIF-1α， VEGF and IGF-Ⅰ.   Methods   Immunohistochemistry PicTure TM method was used to detect the expression of HIF-1α，VEGF and IGF-Ⅰ protein in 42 cases of endometrial adenocarcinoma，10 cases of atypical hyperplasia of endometrium and   20 cases of normal endometrium.   Results  HIF-1α， VEGF and IGF-Ⅰ were expressed in endometrial adenocarcinoma tissues，and the positive rates in atypical hyperplasia were 20%， 30% and 10%， respectively. The positive rates in endometrial carcinoma were 64.29%， 61.90% and 59.52%. In contrast， normal endometrium did not express HIF-1α，VEGF or IGF-Ⅰ. The expres-sions of HIF-1α，VEGF and IGF-Ⅰ protein in endometrial adenocarcinoma were significantly higher than in normal endometrium   tissues （ χ2=22.094-25.261，P <0.01 ）. The positive rate of HIF-1α was strongly associated with the clinical stage. The expres-sion rates of HIF-1α protein in stages Ⅰ， Ⅱand Ⅲ were 42.11%，81.82% and 83.33%， respectively （χ2   =7.435，P <0.05 ）.   There was no relationship between HIF-1α protein expression with age or histological grade （ χ2=0.036，0.634; P >0.05）. The   positive rate of VEGF was strongly associated with the clinical stage . The expression rates of VEGF protein in stages Ⅰ，Ⅱand Ⅲ  were 36.84%， 81.81% and 75.00% （χ2=6.578，P <0.05 ）. There was no relationship between VEGF protein expression and   age or histological grade （χ2=1.879，0.097; P >0.05）. There was no relationship between IGF-Ⅰprotein expression and age or   clinical stage or histological grade （χ2=0.190-0.791，P >0.05）. The expression of HIF-1α was positively associated with VEGF （ r=0.469，P <0.01），The expression of IGF-Ⅰwas positively associated with VEGF（ r=0.452，P <0.01 ），but there was no   relationship between HIF-1α and IGF-Ⅰ（r=0.209， P >0.05）. Conclusion  The overexpression of HIF-1α，VEGF and IGF-Ⅰmay play an important role in the carcinogenesis of endometrial carcinoma. The expression of HIF-1α，IGF-Ⅰis positively associat-  ed with VEGF，but there is no relationship between HIF-1α and IGF-Ⅰ. The overexpression of HIF-1α and IGF-Ⅰ protein induces  the tumor angiogenesis by activating the transcription of VEGF gene. They play important roles in the carcinogenesis of endometri-al carcinoma.  

　　［KEY WORDS］endometrial neoplasmas; hypoxia-inducible factor-1 alpha;vascular endothelial growth factor;insulin-like   growth factorⅠ;immunohistochemistry     

　　子宫内膜癌属于实体肿瘤，新生血管的生成和对低氧的耐受性是实体肿瘤发生、发展和转移过程中不可缺少的两方面。低氧诱导因子（HIF-1）是低氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，该因子可调节多种靶基因如血管内皮生长因子（VEGF）、红细胞生成素等的表达。近年来发现子宫内膜癌组织合成的一些生长因子如VEGF、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）等参与了子宫内膜癌的发生，与子宫内膜癌的发展、转移及预后密切相关。本研究旨在应用免疫组化方法，检测低氧诱导  因子-1α（HIF-1α）与IGF-Ⅰ及VEGF蛋白在正常子宫内膜组织中的表达情况，并结合临床分期及病理  分级进行分析，以探讨HIF-1α与IGF-I及VEGF  蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及其意义，以及三者之间的关系。现报告如下。   

　　1 材料与方法   

　　1.1 标本及来源  

　　收集子宫内膜癌标本42份，按照FIGO 2000年子宫内膜癌分期，42例病人中Ⅰ期19例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例;病理分级分为高分化10例，中分化  19例，低分化13例;病人年龄平均54.1岁。均经临床病理检查确诊。选取诊断性刮宫术确诊为子宫内膜不典型增生标本10份。选取同期因宫颈癌行广泛子宫切除术的正常子宫内膜标本20份作为对照，其中增殖期子宫内膜组织10份，分泌期子宫内膜组织10份。   

　　1.2 试剂及方法  

　　兔抗人HIF-1α抗体、兔抗人IGF-Ⅰ抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;鼠抗人VEGF抗体、PV-6000试剂盒（通用型）、DAB显色试剂盒均  购自北京中山生物技术有限公司。采用免疫化学  PicTureTM通用型二步法，检测HIF-1α、VEGF及IGF-Ⅰ蛋白表达情况。分别用PBS代替3种一抗  作为阴性对照，用已知阳性组织切片作为阳性对照。   

　　1.3  HIF-1α与IGF-I及VEGF蛋白染色结果判断标准  

　　HIF-1α蛋白阳性表达为胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒;VEGF蛋白阳性表达为组织染色呈棕  黄色，主要存在于细胞浆，胞膜和胞浆同时着色亦为阳性;IGF-Ⅰ蛋白表达阳性为胞浆内出现棕黄色细  颗粒。按照ZHONG等［1］的方法，在高倍镜（400  倍）下对每张切片随机选择5个视野，每视野计数  200个细胞，共计数1 000个细胞。阳性细胞计分: 无着色:0分;<1%，1分;1%～10%且弱着色，2分;11%～50%且明显强度着色，3分;>50%且强着色，4分。评分结果:0～1分定为阴性，2～4分定为阳性。   
　　1.4 统计方法  

　　应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，根据  资料的不同性质采用 χ2检验、Fisher精确检验以及  Spearman等级相关分析。    

　　2 结  果   

　　2.1  HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在不同性质子宫内膜组织中的表达  

　　HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在正常子宫内膜组织均不表达，在子宫内膜不典型增生组织中的阳性  表达率分别为20.00%、30.00%和10.00%，而在子  宫内膜癌组织中的阳性表达率则分别为64.29%、     61.90% 和59.52%。三者比较，差异均有显著意义（χ2= 22.094～25.261，P <0.01）。

        2.2  HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系  

　　HIF-1α蛋白在子宫内膜癌组织不同临床分期  中的阳性表达率比较，差异有显著性（ χ2=7.435，P< 0.05）;其中Ⅰ期与Ⅲ期比较差异有显著性（P =0.032），Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期比较差异无显著性（χ2=3.003，P>0.05;P =1.000）;HIF-1α蛋白的表达与病人发病年龄、病理分级无关（χ2=0.036 、0.634 ，P >0.05）。VEGF蛋白在子宫内膜癌组织不同临床分期中的阳性表达率比较，差异有显著性（χ2=6.578，P <0.05）;其中Ⅰ期与Ⅱ期比较差异有显著性（ P =0.029），Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅱ期与Ⅲ期比较差异无显著性（ χ2=0.057，P>0.05;P =0.545）;  VEGF蛋白的表达与病人发病年龄、病理分级无关（χ2 =1.879、0.097，P >0.05）。子宫内膜癌组织中IGF-Ⅰ蛋白阳性表达率与病人发病年龄、临床分期及病理分级无关（ χ2=0.190～0.791，P >0.05 ）。见表1。表1 HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（略）   

　　2.3  子宫内膜癌组织中HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白表达的相关性   子宫内膜癌组织中VEGF表达阳性、阴性者中，HIF-1α表达阳性率分别为73.08%、25.00%，子宫内膜癌组织中HIF-1α蛋白与VEGF蛋白的表  达呈正相关（ r=0.469，P <0.01）。子宫内膜癌组  织中VEGF表达阳性、阴性者中，IGF-Ⅰ表达的阳  性率分别为76.92%、31.25%，子宫内膜癌组织中IGF-Ⅰ蛋白与VEGF蛋白的表达呈正相关（ r=0.452 ，P <0.01）。子宫内膜癌组织中IGF-Ⅰ表达阳性、阴性者中，HIF-1α表达的阳性率分别为68.00% 、47.06%。子宫内膜癌组织中HIF-1α与IGF-I蛋白的表达无相关性（ r=0.209，P>0.05）。  
 
　　3 讨  论   

　　3.1  HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在子宫内膜癌中的表达及其意义   有人对皮肤、肺、胃、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、卵巢等癌组织HIF-1α的表达情况分别作了分析，结果发现在这些癌组织中HIF-1α过表达，且在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘，HIF-1α表达明显增多，而肿瘤组织内的基质细胞和邻近的正常组织则未见HIF-1α的表达［2，3］    。进一步研究显示，结肠、乳腺、前列腺等癌前病变组织中，HIF-1α过表达。SIVIDIS等［4］对81例高分化子宫内膜癌组织检测显示，有49%表达HIF-1α，且表达位于胞浆或胞核，与VEGF上调、微血管密度增高相关。REYNOLDS等［5］的实验证明，在体外培养的子宫内膜癌细胞可以检测到一定数量的IGF-Ⅰ，它有刺激肿瘤细胞增殖的作用。ELKAS等［6］研究显示，在子宫内膜癌中IGF-Ⅰ的表达可能受性激素的调节;有学者对9例子宫内膜癌的检测发现，肿瘤的分化程度越低，IGF-I表达越少，提示IGF-Ⅰ在肿瘤发展中可能起一定的作用。以上研究均表明，HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白过度表达与肿瘤的发生发展密切相关，可作为肿瘤进展的标记物。本研究应用免疫组织化学PicTureTM 方法检测HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ在42份子宫内膜癌、10份子宫内膜不典型增生及20份正常子宫内膜组织中的表达情况，结果显示，HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在正常子宫内膜组织中表达缺失，在子宫内膜不典型增生组织中为低表达，而在子宫内膜癌中高表达。说明HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白与子宫内膜癌的发生发展有关，是促进和保持细胞恶性转化的重要因素。由于我们随访时间尚短，HIF-1α的表达与子宫内膜癌预后的关系还需要进一步研究。   

　　3.2  HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ蛋白在子宫内膜癌组织中表达的相关性

　　许多肿瘤细胞都可以分泌VEGF，同时肿瘤组  织尤其是浸润边缘区域的血管内皮上VEGF受体亦呈现强表达。VEGF与肿瘤血管内皮细胞的相应受体结合刺激肿瘤血管内皮细胞增生，增加血管的  通透性，为肿瘤生长、浸润和转移提供适合的物质基  础。由于肿瘤细胞过度增生，而血管生长相对不足  引起新生瘤细胞局部相对低氧，低氧又反馈性刺激  VEGF表达，促使血管增生，这为肿瘤进一步发展创  造了条件。  SHWEIKI等［7］研究显示，在肿瘤坏死区附近细胞的VEGF表达增高，并且随着肿瘤细胞低氧程度的加重，VEGF表达增高。目前的研究表明，在低  氧时调节VEGF的信号传导途径中，HIF-1起中枢纽带作用，它的功能不仅使VEGF的mRNA稳定性增加，而且能增加VEGF的转录活性［8］。AKAGI等［9］研究结果表明，IGF-Ⅰ能刺激结肠癌细胞株产生VEGF，促进肿瘤血管的生成，对肿瘤的生长和转移有重要作用。BERMONT等［10］还发现，IGF-Ⅰ可以在转录后水平增加子宫内膜细胞VEGF的表达，调节血管的生成和肿瘤的发展。本研究表明，子宫内膜样腺癌组织中的HIF-1α、IGF-Ⅰ蛋白表达与VEGF呈正相关，IGF-Ⅰ蛋白与HIF-1α蛋白的表达无相关性，提示HIF-1α与IGF-Ⅰ蛋白可能通过上调VEGF蛋白的表达，促进  肿瘤血管的生成而促进子宫内膜癌的发生。总之，本研究的结果显示，HIF-1α、VEGF、IGF-Ⅰ在子宫内膜癌组织中高表达，HIF-1α与IGF-Ⅰ蛋白通过上调VEGF蛋白的表达，促进肿瘤的血管生成而促进子宫内膜癌的发生。研究三者在子宫内膜癌中的表达，并干预其中某个因素，研究其他因素的相应变化，有可能为临床治疗提供依据和方向。抑制HIF-1α、IGF-Ⅰ蛋白及其作用途径，将为子宫内膜癌的诊断、治疗及预防开辟一条新的途径。   

　　［参考文献］   

　　［1］ ZHONG H， DE-MARZO A M， LAUGHNER E，et al. Over-  expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in common hu-  man cancers and their metastases［J］. Cancer Res，1999，59:   5830. 

　　［2］ MARXSEN J H， SCHMITT O， METZEN E， et al. Vascular endothelial growth factor gene expression in human breast cancer cell line MX-1 in controlled by O2 availability in vitro   and in vivo［J］. Ann Anat，2001，183: 243.  

　　［3］ WIESENER M S，MUNCHEHAGEN D M，BERGER I，etal. Constitutive activation of hypoxia-inducible genes related to   overexpression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in clear cell   renal carcinomas［J］. Cancer Res， 2001， 61: 5215.  

　　［4］ SIVRIDIS E， GIATROMANOLAKI A， GATTER K C， et   al. Association of hypoxia-inducible factors 1 aplpha and 2 apl-ha with activated angiogenic pathways and prognosis in pa-tions with endometrial carcinoma［J］. Cancer， 2002， 95（5）:   1055.  

　　［5］ REYNOLDS R K， HU C， BAKER U V. Transforming   growth factor-alpha and insulin-like factor-1， but not epider-  mal growth factor，elicit autocrine stimulation of mitogenesis   in endometrial cancer cell lines［J］. Gynecol Oncol， 1998， 70:   202.  

　　［6］ ELKAS J， GRAY K，HOWARD L，et al. The effects of  tamoxifen on endometrial insulin-like growth factor-1 expres-sion［J］. Obstet Gynecol， 1998， 91: 45.  

　　［7］ SHWEIKI D，ITRIN A，SOFFER D， et al. Vascular endo-  thelial growth factor induced by hypoxia may media hypoxia-  mediated angiogenesis［J］. Nature， 1992， 359: 843.  

　　［8］ DAMERT A， MACHEIN M， BREIER G， et al. Up-regula-  tion of vascular endothelial growth factor expression in a rat   glioma is conferred by two distinct hypoxia-chriven mecha-  nisms［J］. Cancer Res，1997， 57: 3860.  

　　［9］ AKAGI Y，LIU W，ZEBROWSKI B，et al. Regulation of   vascular endothelial growth factor expression in human colon   cancer by insular-like growth factor-Ⅰ ［J］. Cancer Res， 1998，58: 4008.  

　　［10］ BERMONT L， LAMIELLE F，FAUCONNET S， et al. Reg-ulation of vascular endothelial growth factor expression by in-sulin-like growth factor-Ⅰin endometrial adenocarcinoma cells［J］. Int J Carcer， 2000， 85（1）: 117.  

　　1 淄博市妇幼保健院妇科，山东 淄博 255029;

　　2 青岛大学医学院附属医院妇产科;

　　3 青岛大学医学院附属医院病理科