HIF-1α和VEGF表达与膀胱癌生物学行为关系的研究

　　【摘要】 目的  探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）在膀胱肿瘤发生、发展中的作用。 方法  采用免疫组织化学染色方法对62例原发膀胱移行细胞癌及8例正常膀胱组织中HIF-1α和VEGF的表达进行检测，回顾性分析HIF-1α和VEGF表达与肿瘤病理分级、临床分期、复发的关系。 结果  膀胱癌组织中HIF-1α和VEGF的阳性表达率分别为46.8%和56.5%，而8例正常膀胱粘膜组织HIF-1α和VEGF表达均为阴性。HIF-1α和VEGF表达与膀胱肿瘤病理分级、临床分期、复发密切相关。同时本次试验结果显示，HIF-1α表达和VEGF表达呈显著正相关。 结论  HIF-1α和VEGF表达对膀胱癌生物学行为有重要影响，同时检测HIF-1α和VEGF的表达情况，对于判定膀胱癌复发、转移和预后更有价值。

    An investigation on relation of HIF-1αand VEGF expression with the biological behavior of bladder cancer

    Wang Xing，Sun Lanfen

    Department of Pathology，The Third Municipal Hospital of Tianjin，Tianjin300250.
   
    【Abstract】 Objective To evaluate expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）and its relation to vascular endothelial growth factor（VEGF）in bladder cancer.Methods HIF-1αand VEGF were examined with immunohistochemical stain method in68cases of transitional-cell carcinoma（TCC）and8subjects of normal bladder mucosa.Results Positive rates of HIF-1αand VEGF were46.8%and56.5%respectively in TCC cases and no expression was observed in normal specimens.The HIF-1αexpression were both significantly related with VEGF，pathologic grade，clinical stage and recurrence.Conclusion HIF-1αand VEGF may be cooperative effects in the recurrence and development of TCC and they could be used as an important biologic marker to TCC.

    【Key words】 bladder neoplasms HIF-1α VEGF immunohistochemistry

    缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）是近年发现的一种在哺乳动物组织中广泛存在的转录因子，组织处于缺氧状态时它发挥转录和基因调控作用。现已经知道，HIF-1α可以被多种因素刺激活化，影响细胞生长、分化、存活及凋亡，具有重要的生理和病理作用。其中某些癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活对HIF-1表达的影响成为研究的重点。已有研究表明HIF-1α在肝癌、乳腺癌、脑肿瘤等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为 ［1］ 。我们采用免疫组化技术检测膀胱移行细胞癌中HIF-1α和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth fac-tor，VEGF）的表达，以研究HIF-1α在膀胱癌中的作用及与血管生长调节的关系。

    1 材料与方法

    1.1 组织标本 62例标本全部来本院和天津市第二医院泌尿外科研究所1998～2003年期间行手术切除的原发性膀胱癌石蜡包埋标本。全部标本中，男55例，女7例。年龄38～75岁，平均62.2岁。按WHO分级标准:G 1 级15例，G 2 级27例，C 3 级20例。临床分期按UICC标准:Tis～T 1 为32例，T 2 ～T 4 为30例。另取8例正常膀胱组织作对照。

    1.2 主要试剂 鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;鼠抗人VEGF单克隆抗体、SP工作液试剂盒和DAB显色剂均购自福建迈新生物技术开发公司。

    1.3 免疫组化检测 HIF-1α表达的检测:染色方法参照说明进行，组织标本常规石蜡包埋，制成4μm切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波炉加热至沸后断电，间隔10min重复2次，冷却后0.1mol/L PBS洗涤，抗原修复液修复抗原，山羊血清封闭后不洗，滴加1:1000稀释的HIF-1α单克隆抗体，4℃过夜，0.1mol/L PBS洗涤后加生物素标记羊抗鼠二抗，30℃染色20min后，0.1mol/L PBS洗涤，滴加试剂SABC，室温放置20min后，DAB显色，苏木素轻度复染，二甲苯透明，封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。HIF-1α染色结果判定:光镜下观察，以棕黄色染色为阳性，不着色为阴性。400倍光镜下双盲法计数100个肿瘤细胞的阳性染色数，平均阳性染色细胞>20%为阳性。VEGF表达的检测:染色方法同HIF-1α表达的检测。VEGF染色结果判定:以肿瘤细胞胞浆内含有棕黄颗粒者计为阳性，依据切片内阳性细胞数比值将其分为3个程度:低度表达（阳性细胞数<50%），中度表达（阳性细胞数50%～80%），高度表达（阳性细胞数>80%）。

    1.4 统计学处理 对取得的数据进行χ 2 检验、方差分析及相关性分析，统计结果以P<0.05为相差显著。

    2 结果

    8例正常膀胱粘膜中均未见HIF-1α表达，膀胱癌细胞HIF-1α阳性反应29例（46.8%），在浅表性膀胱癌中HIF-1α主要分布于基底膜和邻近乳头中央的癌细胞，在浸润性膀胱癌中HIF-1α阳性表达于癌细胞及其周围细胞外基质。随着病理分级和临床分期增高，HIF-1α阳性表达率增加。8例正常膀胱组织移行上皮细胞VEGF表达极弱或不表达。62例膀胱癌中VEGF阳性反应35例（56.5%），VEGF主要着色部位为癌细胞浆和癌细胞周围微血管内皮细胞，VEGF表达与膀胱癌病理分级、临床分期及预后密切相关。HIF-1α表达和VEGF表达的相关分析结果表明:HIF-1α表达和VEGF表达呈显著正相关，VEGF随HIF-1α表达的增高而增高（r=0.9864，P<0.05）。VEGF和HIF-1α表达与病理分级、临床分期及复发的关系见表1。

    表1 膀胱癌HIF-1α和VEGF表与病理分级、临床分期及复发的关系 阳性数（略）注: * P>0.05， ** P<0.05

    3 讨论

    膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，其特点是发病率高、复发率高、恶性程度低。虽然初发时，80%的肿瘤系恶性程度较低的乳头状瘤，但多次复发不但给病人造成巨大的身心痛苦和经济负担，而且每次复发肿瘤恶性程度升高，最终危及病人生命。由于肿瘤生物学行为的异质性，目前尚无特异指标预测其生物学特性来指导临床选择最佳治疗方案。为寻找可预测膀胱肿瘤生物学行为的特异、敏感指标，我们回顾性地分析、研究了HIF-1α和VEGF在膀胱肿瘤的表达与病理分级、分期及复发的关系。HIF-1最先由Semenza于1992年作为被低氧诱导的、连接在红细胞生成素基因低氧反应元件（hypoxia response element，HRE）上的一个核因子被发现 ［2］ 。HIF-1是由al-pha和beta两个蛋白亚基组成的一种异源二聚体蛋白复合物，编码二者的基因分别定位于人类第14号染色体q21～24区和第1号染色体q21区。alpha和beta亚基均包含bHLH结构域、PAS结构域以及羧基末端的反式活化结构域。基本的bHLH区域介导二聚体形成，从而完成完整的DNA连接区域，PAS区域使蛋白高效地形成二聚体。bHLH和PAS结构域共同提供了亚单位之间蛋白二聚化的功能界面 ［3］ 。HIF-1α多肽链全长826个氨基酸残基，是惟一的氧调节亚单位，它决定HIF-1的活性，O 2 对HIF-1活性的调节主要通过该亚基 ［4］ 。在低氧条件下，HIF-1产生并作为蛋白性调节因子与多种靶基因结合调节其转录活性，介导组织细胞产生一系 列的缺氧适应性反应;在恶性肿瘤中，HIF-1的活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成、促进肿瘤增殖和转移中起重要作用。本研究发现:HIF-1α的表达与膀胱癌的病理分级、临床分期、复发均率密切相关，提示HIF-1α表达与膀胱肿瘤的生物学行为有关，可作为膀胱肿瘤生物学行为的标志及生物治疗的靶点 ［5］ 。恶性肿瘤细胞通过新生的血管组织获得必要的养分，带走大量的新陈代谢产物，同时瘤细胞穿过新生的毛细血管经由血路远处转移。迄今为止，VEGF被认为是肿瘤组织中促血管生长的最主要的血管生长因子之一。它高表达于多种恶性肿瘤，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌和肾癌等 ［6］ 。本研究结果显示:VEGF蛋白在膀胱癌组织中呈高表达，而在正常尿路上皮中低表达或不表达。膀胱癌是富血管性恶性肿瘤，VEGF高表达将有助于膀胱肿瘤的血管新生。随着膀胱癌分期分级的提高，VEGF蛋白免疫染色明显增强，这表明VEGF可能与膀胱肿瘤的生长和浸润密切相关，其表达愈强，膀胱癌的恶性度愈高，提示VEGF可作为反应膀胱癌生物学行为的一个重要指标VEGF是新生血管的关键调控者，其表达受许多外部因子调控。其中HIF-1诱导VEGF转录活性的增强和表达增加，在肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成、促进肿瘤增殖和转移中起重要作用。HIF-1对VEGF的调控机制基本阐明，HIF-1通过与VEGF5′端增强子相互作用来实现对VEGF的转录调节。在VEGF5′端增强子内存在HIF-1结合位点HRE。当HIF-1DNA结合活性被诱导，HIF-1便与之结合，使VEGF的转录活性和表达增强。有研究表明，诱导HIF-1突变则不能与VEGF增强子内的HRE结合，使增强子的作用不能发挥。此时VEGF mRNA水平显著降低，即使在低氧条件下，VEGF mRNA也未被诱导表达;诱导VEGF上的HRE缺失，同样使HIF-1不能与其结合而发挥转录作用 ［7］ 。Liu等 ［8］ 于新近发现，HIF-1在调节VEGF的转录活性和VEGF mRNA稳定性两个方面来影响VEGF的表达。HIF-1α的过度表达则会提高VEGF mRNA的水平。本研究发现，HIF-1α表达和VEGF表达呈显著正相关，说明两者与膀胱移行细胞癌的生物学行为关系密切，可能共同对膀胱癌的发生进展起促进作用。同时检测VEGF和HIF-1α的表达情况，对判定膀胱癌的恶性程度、自然病程及预后方面更有意义。

    参考文献

    1 Giatromanolaki A，Harris AL.Tumour hypoxia，hypoxia signaling path-ways and hypoxia inducible factor expression in human cancer.Anti-cancer Res，2001，21（6B）:4317-4324.

    2 Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de no-vo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation.Mol Cell Biol，1992，12（12）:5447-5454.

    3 Semenza GL，Agani F，Booth G，et al.Structural and functional analysis of hypoxia-inducible factor1.Kidney Int，1997，51（2）:553-555.

4 Huang LE，Gu J，Schau M，et al.Regulation of hypoxia-inducible fac-tor1alpha is mediated by an O2 -dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（14）:7987-7992.

    5 Streeter EH，Harris AL.Angiogenesis in bladder cancer-prognostic marker and target for future therapy.Surgical Oncology，2002，11:85-100.

    6 Dvorak HF，Brown LF.Vascular permeability factor/vascular endothe-lial growth factor，microvascular hyperpermeability，and angiogenesis.Am J Pathol，1995，146:1029-1039.

    7 Jones A，Fujiyama C.Relation of vascular endothelial growth factor production to expression and regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha and hypoxia-inducible factor-2alpha in human bladder tumors and cell lines.Clin Cancer Res，2001，7（5）:1263-1272.

    8 Liu LX，Lu H.Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia-inducible factor1.Biochem Biophys Res Commun，2002，291（4）:908-914.

    作者单位:300250天津市第三医院病理科