褪黑激素对严重烧伤大鼠血管通透性的影响

　　［摘要］目的 观察褪黑激素对严重烧伤大鼠血管通透性的影响。方法 30只大鼠随机分为假烫对照组、烧伤对照组和褪黑激素组，每组10只。将麻醉动物背部皮肤置于沸水或37 ℃水中15 s，造成30% Ⅲ度烫伤或假烫伤。假烫对照组和烧伤对照组术后立即腹腔注射溶剂（体积分数0.01的乙醇生理盐水），而褪黑激素组腹腔注射10 mg/kg褪黑激素。烧伤后6 h取血和皮肤、肝、肾、肺组织进行测定。结果 严重烧伤可导致血细胞比容（HCT）增加（ F=15.19，q=7.79，P <0.01），血浆总蛋白（TP）浓度下降（ F=5.95，q=4.50，P <0.05），血浆丙二醛（MDA）水平升高（ F=8.06，q=5.57，P <0.01）。以上改变可部分被褪黑激素所拮抗（ F=5.95～15.19，q=3.44～3.81， P < 0.05、0.01）。烧伤后肾、肺和皮肤组织MDA水平均明显升高（ F=11.18～66.46，q=3.95～16.25，P < 0.01 ）。褪黑激素治疗使肾和肺组织MDA降至假烫对照组水平（ F=11.18、21.30，q=2.42～7.43，P <0.01），使皮肤MDA降低25.4%（ F=66.46，q=7.98，P <0.01）。褪黑激素还降低了肺和皮肤组织的含水量（ F=9.81、 14.79 ， q= 3.18～4.66，P <0.05、0.01）。结论 褪黑激素在严重烧伤大鼠中具有很强的抗氧化作用，早期应用能显著降低血管通透性和减轻组织水肿。

　　［关键词］ 褪黑激素;烧伤;血管;通透性;水肿;丙二醛;大鼠

　　EFFECTS OF MELATONIN ON VASOPERMEABILITY IN SEVERELY-BUREND RATS

　　HAN XIAO-HUA

　　（Department of Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）
　　
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effect of melatonin on vasopermeability in severely-burned rats. MethodsThir-ty male SD rats were randomly assigned to three groups， sham control， burn control and melatonin group， with 10 rats in each group. The skin of back of the anesthetized animals was placed into boiling water or 37 ℃ water for 15 s to result in 30% full-thickness burn or sham burn. The rats in sham control and burn control groups were given intraperitoneally （i.p.） vehicle （1% ethanol in 0.9% saline）， while melatonin-treated rats received melatonin at a dose of 10 mg/kg. The blood sample and tissue sam-ples （liver， lung， kidney， burned skin） were collected at six hours after the burn for detection. ResultsSevere burn increased hematocrit （HCT） （ F=15.19， q=7.79， P <0.01）， decreased concentrations of plasma total protein （TP） （ F=5.95， q=4.50， P <0.05） and elevated the level of plasma malondialdehyde （MDA）（ F=8.06， q=5.57， P <0.01）. These alterations were partly counteracted by melatonin therapy （ F=5.95-15.19; q=3.44-3.81; P <0.05， 0.01）. Compared to the sham control， the MDA levels of kidney， lung and skin were markedly higher （ F=11.18-66.46， q=3.95-16.25，P <0.01）. Melatonin decreased both kidney and lung MDA to the level of sham control （ F=11.18，21.30; q=2.42-7.43; P <0.01）， and declined the skin MDA level by 25.4% （ F=66.46， q=7.98， P <0.01）. Furthermore， melatonin lowered the water content of both lung and skin （ F= 9.81 ，14.79; q=3.18-4.66; P <0.05， 0.01）. ConclusionMelatonin possess strong antioxidation in severely-burned rats， early application of it may markedly decrease vasopermeability and edema.

　　［KEY WORDS］ melatonin; burn; blood vessel; permeability; edema; malondialdehyde; rats
　　
　　烧伤后血管通透性的增加可导致体液的大量外渗，一方面使循环血量锐减和血液浓缩，诱导低血容量休克的发生;另一方面引起局部和远隔脏器的水肿，加重原有的组织损伤［1］。现已证明，过量的氧自由基是导致烧伤早期血管通透性增加的重要机制之一［2，3］。早期应用抗氧化剂（如SOD、Vit E等）可改善血管通透性，减少休克的发生［3，4］。褪黑激素是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素，具有改善睡眠、调节性腺分泌、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化及免疫调节等多种生物学功能［5，6］。最近，SENER等［7］ 研究发现，褪黑激素能明显抑制烧伤后内脏组织的脂质过氧化损伤。本实验通过制备30%Ⅲ度烫伤大鼠模型，进一步观察了褪黑激素的抗氧化作用及其对血管通透性的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1动物 选用30只健康雄性SD大鼠，体质量200～250 g，由青岛市药检所动物中心提供［合格证号:SCXK（鲁）20030010］。动物置于室温24 ℃左右，自由饮食。

　　1.1.2药品 褪黑激素、戊巴比妥钠、磷钨酸、硫代 巴比妥酸、1，1，3，3-四乙氧基丙烷、牛血清清蛋白等为美国Sigma公司产品，余试剂为国产分析纯。

　　1.1.3仪器 Genesys 2型分光光度计系加拿大Milton Roy公司产品;恒温水浴箱和Ultra Turrax T25型匀浆机为德国Julabo Labortechnik公司产品;电烤箱系德国Memmer公司产品;Jouan MR22型低速离心机为英国Line Analytics Ltd公司产品;血细胞比容（HCT）离心机和阅读器系美国Hawks-ley公司产品。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1烧伤模型制备及药物干预 30只大鼠随机分为假烫对照组、烧伤对照组和褪黑激素组，每组10只，均以50 g/L戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后背部剃毛。烧伤对照组和褪黑激素组将30%体表面积的背部皮肤浸入沸水中15 s，造成30% Ⅲ度烫伤［8］，伤后立即腹腔注射体积分数0.01的乙醇生理盐水或褪黑激素10 mg/kg（溶于乙醇后用100倍生理盐水稀释），30 min后两组大鼠腹腔注射15 mL生理盐水行抗休克治疗。假烫对照组除背部浸入 37 ℃水 及未补液外，其余同烧伤对照组。所有大鼠于伤后6 h进行以下操作:①心脏取血1.5 mL，抗凝，立即测定HCT及制备血浆;②快速剪取部分烧伤皮肤及主要内脏（肝、肺、肾）组织，分别称取大约200 mg组织用于测定组织含水量，其余投入液氮中，-20 ℃保存。
　　
　　1.2.2标本制备 ①血浆:1 mL全血中加入肝素20 U抗凝，4 500 r/min离心10 min后取血浆，测定血浆总蛋白（TP）和血浆丙二醛（MDA）含量。②组织标本:200 mg组织加入10倍体积的磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.4，4 ℃），高速匀浆机匀浆后离心（3 000 r/min，30 min），取上清液测定组织MDA含量。

　　1.2.3测定指标 ①HCT:用肝素抗凝的毛细管吸取双份血样，在HCT离心机中离心（6 500 r/min， 5 min ）后读数，取平均值。②血浆总蛋白含量:参照BIURET法测定［9］。③血清和组织MDA含量:采用硫代巴比妥酸比色法测定［10］。④组织蛋白含量:按LOWRY法测定［11］。⑤组织含水量:取200～250 mg组织，用滤纸吸干表面的渗液及血迹，称湿质量，80 ℃烘烤72 h再称干质量，计算组织含水量。组织含水量（%）=［（湿质量-干质量）/湿质量］×100%［12］。
　
　　1.2.4 统计学处理采用Prism 4.0统计软件包进行分析，数据以 x±s 表示。各组均数比较采用单 因素方差分析及Newman-Keuls检验。

　　2 结果

　　2.1 褪黑激素对烧伤后大鼠血液HCT、血浆TP和MDA含量的影响 与假烫对照组相比，烧伤对照组HCT明显增加（ F=15.19，q=7.79，P <0.01），而血浆TP浓度则显著下降（ F=5.95，q=4.50，P <0.05）。腹腔注射褪黑激素可部分抑制HCT的增加（ F=15.19， q= 3.81，P < 0.05 ），并显著提高血浆TP水平（ F=5.95，q= 3.74 ，P <0.05）。此外，烧伤亦导致血浆MDA水平明显升高（ F=8.06，q=5.57，P <0.01），该变化可被褪黑激素所拮抗（ q=3.44，P <0.05）。见表1。

　　2.2 褪黑激素对烧伤后组织MDA含量的影响 烧伤后肾、肺和皮肤组织MDA水平均明显升高，分别增加53.0%、39.6%、143.1%（ F=11.18～66.46，q=3.95～16.25，P <0.01）。褪黑激素治疗可使肾和肺组织MDA降至假烫对照组水平（ F=11.18、21.30，q=2.42～7.43，P <0.01），而使皮肤MDA降低25.4%（ F=66.46，q=7.98，P <0.01）。而肝脏组织内MDA水平在各组之间无明显差异（ P > 0.05 ）。见表2。

　　2.3 褪黑激素对组织含水量的影响 与假烫对照组相比，烧伤后肺及皮肤含水量明显增加，褪黑激素治疗后，肺和皮肤含水量明显降低（ F=9.81、14.79，q=3.18～4.66，P <0.05、0.01），但未完全恢复至假烫对照组水平。肝脏及肾脏含水量在各组之间无明显差异（ P >0.05）。见表3。

　　表1 褪黑激素对烧伤后大鼠HCT、血浆TP和MDA含量的影响（略）

　　表2 褪黑激素对烧伤后大鼠内脏和皮肤MDA含量的影响（略）

　　表3 褪黑激素对烧伤后大鼠组织含水量的影响（略）
　　
　　3 讨论

　　血管通透性升高是烧伤早期的特征性改变，其发生机制除了热能对微血管的直接损伤外，主要是烧伤后组织缺血、低氧以及各种炎症递质引起的血管内皮细胞损伤所致［2，3］。大量体液外渗和脏器水肿可导致休克发生和脏器功能不全。因此，如何降低血管通透性是烧伤早期治疗中的一项重要课题。研究表明，氧自由基损伤（即氧化应激损伤）是导致烧伤后血管通透性增加的重要致病因子［2，3，13］。严重烧伤后， 由于黄嘌呤氧化酶系统及中性粒细胞的激活释放大量的氧自由基，后者与膜磷脂多价不饱和脂肪酸作用，形成脂质过氧化物（LPO），LPO可损伤血管内皮细胞和导致血管通透性升高。因此，抗氧化剂的合理应用，可作为烧伤早期抗休克治疗中重要的辅助性措施。褪黑激素是近年来发现的强效抗氧化剂，它在侧链N-乙酰基的协同作用下，利用5位上的甲氧基可直接清除机体内各种氧自由基及活性产物，如羟自由基、脂质过氧化物、过氧化氢以及超氧负离子等［5，6］。本研究结果表明，烧伤后血浆及肺、肾、皮肤等组织内丙二醛（脂质过氧化终产物之一）含量均明显升高，表明机体存在明显的自由基损伤。肝脏MDA含量在烧伤前后无明显变化，该结果与SAI-TOH等［3］的报道相类似。这可能与MDA测量中常受到其他因素的干扰而出现一定的偏差有关。因此，在估计肝脏及其他组织的氧化应激损伤时，可将MDA和其他指标（如GSH）联合应用。本实验中用褪黑激素干预后血浆和组织MDA水平均显著下降，甚至使肾和肺组织MDA降低到对照组水平，说明褪黑激素在烧伤中具有很强的抗氧化作用。烧伤后血管通透性升高的直接结果是组织和脏器水肿。组织水肿的形成取决于烧伤的严重程度、烧伤早期的治疗及脏器本身的易感性等多种因素［1］。本研究在30% Ⅲ度烧伤及早期补液的大鼠中发现，烧伤后早期皮肤及肺脏存在明显的组织水肿，但肝脏及肾脏的含水量并无明显变化。与其他脏器相比，由于组织缺血低氧和血管活性物质的作用，尤其是GSH等内源性抗氧化剂的缺乏以及大 量中性粒细胞的聚集和活化，肺脏是烧伤早期最早发生组织水肿的部位。有研究表明，烧伤严重程度的增加（如40% Ⅲ度烧伤）或早期未及时补液时，肝脏及肾脏也会出现明显的组织水肿［3，13］。本研究还发现，褪黑激素治疗对皮肤和组织水肿具有一定的抑制作用，该作用可能与其抗氧化作用密切相关。

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　　（本文编辑 马伟平）

　　（青岛大学医学院生理学教研室，山东 青岛 266021）