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［摘要］目的 通过对病理性瘢痕组织中c-fos和5-HT表达变化的研究，探讨其与病理性瘢痕痛痒和增生的关系。方法 利用免疫组化方法检测病理性瘢痕和正常皮肤中c-fos和5-HT的表达情况。结果 痛痒的病理性瘢痕组织中c-fos、5-HT的表达显著高于正常皮肤组织和非痛痒的瘢痕组织（ F=19.86、17.61，q=5.43～8.84， P < 0.01）;非痛痒的瘢痕组织中c-fos的表达显著高于正常皮肤（ q=3.41，P <0.01），而5-HT表达无明显差异（ P > 0.05 ）。结论 c-fos、5-HT表达增高可能导致病理性瘢痕临床痛痒症状的发生，c-fos表达增高可能与病理性瘢痕的形成、发展有关。
［关键词］ 瘢痕;原癌基因蛋白质c-fos;血清素;疼痛;瘙痒症;增生
EXPRESSIONS OF c-fos AND 5-HT IN ABNORMAL SCARS AND THEIR RELATIONSHIP WITH HYPERPLASIA ， ITCH AND PAIN
CHEN ZHEN-YU， ZHANG WEI-NA， MIAO YUAN-XIN， et al
（Department of Plastic and Cosmetic Surgery， The Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of two mediums， i.e. c-fos and 5-HT， in abnormal scars and their rela-tionship with hyperplasia， itch and pain. MethodsThe immunohistochemistry method was applied to study expressions of c-fos and 5- hydroxytryptamine （5-HT） in pathologic scars and normal skin. ResultsIn the itching or painful scars， c-fos and 5-HT expressions were all significantly higher than those in non-itching or painful scars and normal skin （ F=19.86，17.61;q=5.43- 8.84 ; P <0.01）; the expression of c-fos in non-itching or painful scars was higher than that with normal skin （ q=3.41， P < 0.01 ）， while 5-HT expression was of no difference （ P >0.05）. ConclusionThe high expressions of c-fos and 5-HT may induce itching and painful symptoms of abnormal scars， and c-fos may contribute to the formation of the abnormal scars.
［KEY WORDS］ scar; proto-oncogene proteins c-fos; serotonin; pain; pruritus; hyperplasia
瘙痒和灼痛是病理性瘢痕常见的临床症状，尤其在瘢痕增生的早期，往往痛痒越重者，瘢痕增生越快，但是痛痒的发生机制很复杂，涉及到神经生理、内源性生化物质等多个方面。许多体内外的因素及细胞受损后所产生的物质均能引起痛痒，其机制目前尚不十分清楚。本研究采用免疫组化方法检测原癌基因c-fos和5-羟色胺（5-HT）在痛痒、非痛痒瘢痕及正常皮肤组织中的表达情况，旨在探讨这两种生化递质的变化与病理性瘢痕增生及其痛痒症状相关性，为临床治疗瘢痕增生及痛痒症状提供新思路。
1 材料和方法
1.1 标本的取材与分组 瘢痕标本均来源于我院整形外科门诊手术病人（病程6～24个月）典型的病理性瘢痕（瘢痕疙瘩或 增生性瘢痕）组织，标本取瘢痕中心部分0.7 cm×1.0 cm全层组织块;正常皮肤取自美容手术病人，修剪至0.5 cm×0.7 cm大小。A组（痛痒瘢痕组）:瘢痕潮红，高出皮面，触之硬，具有明显的瘙痒或刺痛症状;B组（无痛痒瘢痕组）:无任何自觉症状;C组（正常皮肤组）:取自无瘢痕体质及免疫性疾病的外科手术病人，每组标本20例。
1.2 免疫组化检测及结果判定 采用通用型二步法，兔抗人5-HT多抗（工作液）为美国Zymed公司产品，兔抗人c-fos多抗（稀释度1∶100）为美国Santa Cruz公司产品，Pic-TureTM-PV6000免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。其中，检测c-fos行微波抗原修复。DAB显色，镜下控制显色时间。阴性对照省略一抗，以PBS代替。染色阳性信号为细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒。
1.3 图像定量分析采用 VIDAS 图像分析系统（德国 Opton 公 司），设定灰度级为256级，白为0，黑为255;每组切片随机选取5张，光镜下（40倍）每张切片按系统抽样法随机取10个视野;对所测定组织的背底进行面积、灰度、吸光度测定，制定标准作为参考值;通过计算机自动数据统计系统计算出所测细胞平均吸光度、面密度、积分吸光度，以积分吸光度为主要指标进行定量分析。
1.4 统计学处理 图像分析数据以 x±s 表示，应用SPSS 10.5统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 形态学观察
2.1.1c-fos免疫组化染色 在正常皮肤组织中，c-fos蛋白产物主要分布于表皮基底层细胞、小血管内皮细胞、皮脂腺及毛囊上皮细胞，胞核及胞质均有着色。在痛痒的瘢痕组织中，除表皮基底层细胞、小血管内皮细胞染色阳性外，在胶原结节、漩涡状结构 中的成纤维细胞中呈阳性着色，密度高、着色浓。在无痛痒的瘢痕组织中，c-fos蛋白分布于表皮基底层细胞，但分布密度及着色较痛痒的瘢痕组织淡而稀少，成纤维细胞中c-fos蛋白阳性分布很少。
2.1.25-HT免疫组化染色 5-HT表达阳性细胞主要是表皮基底层细胞、小血管内皮细胞、皮肤附属器、成纤维细胞，痛痒的瘢痕组织5-HT蛋白阳性着色程度及阳性细胞分布范围强于、大于非痛痒的瘢痕组织及正常皮肤组织。
2.2 图像定量分析结果
2.2.1c-fos c-fos阳性分布的平均吸光度、面密度和积分吸光度均以A组最高，C组最低。其中A组和B组c-fos的表达均显著高于C组（ F=19.86，q=3.41、8.84，P <0.01）;A组又显著高于B组（ q= 5.43，P <0.01）。见表1。
2.2.25-HT A组5-HT的表达均显著高于B组和C组（ F=17.61，q=7.86、6.47，P <0.01）;B组和C组相比差异无显著性（ P >0.05）。见表1。
表1 正常皮肤及瘢痕组织中c-fos和5-HT图像分析结果（略）
3 讨论
增生性瘢痕与瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕，是创伤愈合反应过度的结果，表现为瘤样增生并伴有不同程度的痛痒症状，通常痛痒症状越重者，瘢痕增生越快。目前多数学者致力于瘢痕发病机制的研究，而有关病理性瘢痕的痛痒机制研究尚不多见。已有研究证实，瘢痕疙瘩及增生性瘢痕中神经纤维增生、粗大、排列杂乱，其组织中肥大细胞数量增多，提示神经及生化递质的变化与痛痒症状有关，但有关神经纤维及神经递质、生化递质的变化与病理性瘢痕痛痒相关性的研究目前在国内外尚罕见报道。为此，本研究检测了c-fos和5-HT在病理性瘢痕中的表达情况，旨在探讨这两种生化递质的变化与病理性瘢痕增生及其痛痒症状的相关性。
3.1 c-fos 即刻早期基因c-fos是编码核蛋白的癌基因，其产物具有转录调节作用，介导细胞由静止期向增殖期转化并在伤口愈合中起作用。它在大多数正常细胞中表达水平较低，但可受多种炎症递质、炎症细胞 和细胞因子刺激激活，激活后可激活多种炎症递质及细胞因子［1］。原癌基因c-fos的表达与细胞生长、分化和启动细胞的增殖活性密切相关［2］。本研究显示，瘢痕组织中c-fos免疫阳性细胞分布密度显著高于正常皮肤组织。c-fos蛋白产物主要分布于基底层细胞、血管内皮细胞以及增生性瘢痕组织的成纤维细胞中，这些细胞均是功能活跃的细胞。基底层细胞是皮肤组织中有丝分裂和新陈代谢最为活跃的细胞，血管内皮细胞可合成内皮素等许多细胞因子，成纤维细胞是皮肤组织中胶原合成的主要来源，据此推测c-fos的表达可能与这些细胞的功能有关。成纤维细胞是皮肤伤口愈合和瘢痕增生的关键细胞，与胶原和细胞外基质产生密切相关，c-fos在瘢痕组织中呈强阳性表达，提示它们的表达可能在瘢痕增生中起重要作用。有研究表明，瘢痕组织中高水平的TGF-β可不断刺激c-fos的表达，并促进胶原合成，致使瘢痕增生［3］。本文结果与文献报道一致，即病理性瘢痕组织中c-fos的表达高于正常皮肤组织，提示c-fos的激活可能参与了成纤维细胞的分化增殖或表型转化或胶原合成与降解，以及对细胞因子的调控并导致瘢痕异常增生。
近年来研究结果表明，c-fos还与疼痛关系密切。c-fos基础表达水平很低，它在中枢神经系统内的表达与痛觉调制有关，外周伤害性刺激可使脊髓背角c-fos蛋白表达增加，c-fos蛋白可作为伤害性感受神经元被激活的标志物［4］。HUNT等［5］首次证明c-fos与疼痛的关系，即外周的伤害性刺激可以快速诱导c-fos的表达。张仲文等［6］在实验中发现，硬膜外瘢痕粘连和疼痛程度与c-fos表达呈正相关。本研究结果证实，c-fos蛋白在痛痒的病理性瘢痕组织中表达显著高于非痛痒的病理性瘢痕组织，正常皮肤组织仅有少量表达，提示c-fos的激活与病理性瘢痕临床痛痒症状的发生密切相关。目前对这方面的研究尚未见报道，根据原癌基因的生物学，并结合有关体外试验，作者推测:原癌基因c-fos影响瘢痕痛痒可能是通过作用于不同类型细胞（包括组织修复细胞与炎性细胞）和调控生长因子的产生两条途径来实现的，即原癌基因持续高表达将激活成纤维细胞生长因子基因或成纤维细胞，导致组织修复过度，激活炎症细胞又将导致蛋白酶分泌增多而使胞外基质溶解增加，从而释放多种可致痛痒的递质，但其具体作用机制以及c-fos具体高到什么程度才能引起疼痛，还有待于进一步研究。
3.25-HT 作为一种经典的致痛致痒递质，5-HT在体内广泛分布并具有多种生物活性，它不仅是重要的神经递质，也是重要的免疫调节因子。它在周围组织中的致痛机制是:当组织破坏时，5-HT从解体的血小板中释放出来，低浓度即可致痛，且主要参与血管性疼痛、损伤性疼痛。1985年NARA［7］采用Nin-hydin法分别测定了人正常皮肤和瘢痕组织中5-HT的含量，发现5-HT可致创伤愈合后非稳定瘢痕组织的痛痒感，并且发现瘢痕组织中5-HT的多寡与伤后时间长短无关，但与伤后瘢痕状态有关，肥厚、发红并挛缩的非稳定型瘢痕组织5-HT含量明显高于伤后早期稳定型瘢痕组织。但他并未将痛痒和非痛痒的瘢痕明确分组。本研究显示，痛痒的瘢痕组织中5-HT蛋白阳性着色程度及阳性细胞分布范围强于非痛痒的瘢痕组织及正常皮肤组织;非痛痒的瘢痕组织和正常皮肤组织相比无显著差异，提示5-HT表达的升高可导致病理性瘢痕疼痛、瘙痒症状的发生。而NARA在正常人皮肤中未检测到5-HT，可能与不同实验方法有关，他所采用的Nin- hydin法不足以测定出正常人皮肤中微量的5-HT。有关结缔组织代谢与5-HT关系的报道较少，但存在着两方面的意见。NAGAI［8］的实验结果表明，结缔组织中5-HT含量比组胺少得多，认为5-HT在结缔组织中的作用是次要的。崔玉芳等［9］则认为5-HT对离体培养的成纤维细胞也有促增殖作用，且这种作用有时甚至比组胺还强。通过以上的研究推测:c-fos、5-HT可能与病理性瘢痕的临床痛痒症状有关，这两种生化递质的表达增高可能导致痛痒症状的发生，c-fos还可能促进病理性瘢痕的增生。据此，设想若能通过调控瘢痕组织中c-fos、5-HT的含量来抑制瘢痕的生长和减轻瘢痕的痛痒症状，将为病理性瘢痕防治提供一种新途径［10］，但其确切的反应途径和方式还有待于进一步研究。
［参考文献］
［1］ PIECHACZYK M， BLANCHARD J M. C-fos proto-oncogene regulation and function ［J］. Crit Rev Oncol Hematol， 1994，17:93-99.
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［3］ CHODON T， SUGIHARA T， IGAWA H H， et al. Keloid-derived fibroblasts are refractory to Fas-mediated apoptosis and neutralization of autocrine transforming growth factor-beta1 can abrogate this resistance［J］. Am J Pathol， 2000，157:1661-1669.
［4］ BULLITT E， LEE C L， LIGHT A R， et al. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord［J］. Brain Res， 1992， 580:172-181.
［5］ HUNT S P， PINI A， EVANS G. Induction of c-fos like pro-tein in spinal cord neurons following sensory stimulation［J］. Nature， 1987， 328:632.
［6］ 张 仲文，肖光，朱东，等. 硬膜外瘢痕粘连与脊髓中P物质、c-fos的表达［J］.中国现代医学杂志，2001，2:6-8.
［7］ NARA T. Histamine and 5-hydroxytryptamine in human scar tissue［J］. Ann Plast Surg， 1985， 14: 244-247.
［8］ NAGAI U. Connective tissue and mast cell［J］. Metabolism （Jpn）， 1975， 13: 375-384.
［9］ 崔 玉芳，高亚兵，杨瑞彪，等. 组胺对正常和受照NIH/3T3成纤维细胞生长的影响［J］.中华放射医学与防护杂志，1997，17:105-110.
［10］ 赵 秀峰，宋翠凤，苏毅鹏，等. 病理性瘢痕药物治疗进展［J］.齐鲁医学杂志，2005，20（5）:465-466.
（本文编辑 马伟平）
（青岛大学医学院附属医院整形美容科，山东 青岛 266003; 胜利油田中心医院皮肤科）