牛磺酸对大鼠庆大霉素中毒性急性肾损伤的保护作用

【摘要】  目的 观察牛磺酸对庆大霉素引起的中毒性急性肾损伤的保护作用及其机制。方法 将成年Wistar大鼠36只随机分为３组，牛磺酸组（n=12）：腹腔注射庆大霉素100 mg/kg,每天１次，共7 ｄ，于每次注射前6 ｈ腹腔注射100 g/L牛磺酸7.5 mL/kg；庆大霉素组（n=12）：同法注射庆大霉素，腹腔注射生理盐水代替牛磺酸；对照组(n=12)：用等量生理盐水代替庆大霉素及牛磺酸腹腔注射。检测各组大鼠24 ｈ尿量（UV）、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、肌酐清除率（CCr）及肾组织中内皮素１（ET1）的表达，观察肾组织形态学改变。结果 牛磺酸组UV、BUN及SCr低于庆大霉素组（F=30.28～104.99，q=4.58～6.25,P<0.01），CCr高于庆大霉素组（F=22.46，q=5.06,P<0.01）；庆大霉素组肾组织形态学损伤严重，牛磺酸组病变较轻（Hc=31.374，P<0.001）；牛磺酸组肾小管上皮细胞中 ET1的表达明显弱于庆大霉素组（Hc=22.364～26.317，P<0.001）。结论 外源性牛磺酸可通过抑制ET1的合成、释放对庆大霉素中毒性急性肾损伤发挥保护作用。

【关键词】  牛磺酸 肾小管坏死 急性 庆大霉素 内皮素 大鼠

    THE PROTECTIVE EFFECT OF TAURINE ON TOXIC ACUTE RENAL INJURY IN RATSSUN LINGLING, SUN XIANLU, ZHU ZONGLING, et al (Department of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo observe whether taurine provides the protective effect on gentamicininduced toxic acute renal injury.MethodsAdult Wistar rats of both sexes were divided into three groups randomly: Taurine group (n=12),  intraperitoneal injection of gentamicin (100 mg·kg-1·d-1), once a day, for seven days , and  10% taurine solution (7.5 mL·kg-1·d-1) 6 hours before each gentamicin injection; Gentamicin group (n=12),  gentamicin given as the taurine group and the same amount of saline instead of taurine;  Control group (n=12), the same amount of saline instead of gentamicin and taurine . The urine volume (UV), serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), creatinine clearance (CCr); renal histomorphological changes and immunohistochemical expression of endothelin1 in the kidney were observed .ResultsThe UV, SCr and BUN levels of the taurine group were significantly lower than that of the gentamicin group (F=30.28-104.99，q=4.58-6.25,P<0.01), and the CCr level was increased by taurine (F=22.46，q=5.06,P<0.001）. Histomorphologically, the gentamicin group revealed more severe damages than the taurine group did (Hc =31.374，P<0.001). Immunohistochemically, the expression of ET1 in the gentamicin group was much more obvious than that in the taurine group (Hc=22.364-26.317，P<0.001).ConclusionTaurine is effective in protecting the morphology and function of kidneys of rats from gentamicininduced acute renal injury by inhibiting synthesis and releasing  ET1.

    ［KEY WORDS］taurine; kidney tubular necrosis; gentamicin; endothelin; rats

    牛磺酸又称为牛胆碱，化学名为2氨基乙磺酸（分子式HSO3CH2CH2NH2），是一种β氨基酸，它能通过其膜稳定作用和抗氧化作用保护细胞免受氧自由基损害。国内外大量临床及基础实验研究表明,牛磺酸对心、脑、肝等器官病变具有保护作用[1]，但对中毒性肾损伤的作用尚不明确[2]。本实验探讨牛磺酸对实验性庆大霉素中毒性急性肾小管损伤的作用及其可能机制，现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物及分组

    健康成年Wistar大鼠36只，雌雄各半，体质量200～250 g，购于青岛市实验动物中心，随机分为牛磺酸组、庆大霉素组、对照组，各12只。

    1.2  药物及主要试剂

    庆大霉素由青岛国风制药厂提供，批号为021225；牛磺酸购自上海惠兴生化试剂有限公司，批号021109；内皮素1（ET1）单克隆抗体由Santa Cruz公司提供；SABC试剂盒由武汉博士德公司提供。

    1.3  实验方法

    1.3.1  动物处理  牛磺酸组：大鼠腹腔注射庆大霉素100 mg/kg，每天1次，共7 d，于每次注射前6 h腹腔注射100 g/L牛磺酸7.5 mL/kg；庆大霉素组：同法注射庆大霉素，每次注射前6 h腹腔注射生理盐水代替牛磺酸；对照组：用等量生理盐水代替庆大霉素及牛磺酸腹腔注射。

    1.3.2  血、尿生化指标的检测  大鼠留取24 h尿后， 腹腔注射100 g/L乌拉坦（1 g/kg）麻醉，腹主动脉取血放入干净试管析出血清后，测血肌酐 (SCr)、血尿素氮(BUN)；用量筒量取24 h尿量（UV），测尿肌酐值，结合SCr计算内生肌酐清除率（CCr）。

    1.3.3  肾组织形态学观察  取下大鼠肾脏后，剥除被膜，将左侧肾脏纵剖为两半，在40 g/L甲醛溶液中固定24 h后，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，苏木精伊红染色，光镜下观察结果。每张切片观察50个高倍视野，每个视野计数10个肾小管，并按HOUGHTON等[3]的方法，将切片分为5级。0级:肾组织结构无异常；1级：肾小管上皮细胞局灶性颗粒空泡变性，小管腔有颗粒状碎屑，有或无小灶状上皮脱落（<1%肾小管出现上皮脱落）；2级:<50%皮质肾小管出现上皮坏死及脱落；3级：>50%的近端小管出现上皮坏死及脱落，但易见到完好的肾小管；4级：完全或几乎完全的近端小管坏死。

    每组动物中各取1只，迅速从右侧肾脏取下部分肾皮质，切为1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，25 g/L 戊二醛体积分数0.01锇酸双重固定，梯度丙酮脱水，EPON812环氧树脂包埋剂包埋，做半薄切片定位后，用钻石刀做超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，自然干燥后用EX1200透射电镜进行观察。

    1.3.4  ET1表达检测  采用免疫组织化学染色方法，应用SABC试剂盒检测，按试剂盒说明书进行操作。结果判断：每张切片观察50个高倍视野，每个视野计数100个细胞，分别按阳性细胞百分数及染色强度计分[4]。①无细胞着色计0分；1%～25%细胞着色计1分；26%～50%的细胞着色计2分；51%～75%细胞着色计3分；76%～100%的细胞着色计4分。②不显色或背景深，染色不清晰计0分；胞浆淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。两者相加，0分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5 分为阳性（），6～7分为强阳性（）。

    1.4  统计学处理

    计量资料以±s表示，数据间比较采用F检验及秩和检验。

    2  结    果

    2.1  各组肾功能指标比较    庆大霉素组、牛磺酸组UV、BUN及SCr水平均高于对照组（F=30.28～104.99,q=5.32～11.26,P<0.01）；牛磺酸组UV、BUN及SCr水平均低于庆大霉素组（q=4.58～6.25,P<0.01）。庆大霉素组及牛磺酸组CCr水平低于对照组（F=22.46，q=6.13、3.51，P<0.05）；牛磺酸组CCr水平高于庆大霉素组（q=5.06,P<0.01）。见表1。

    表1  各组大鼠肾功能指标比较(±s)组  别UV(V/mL)BUN(c/mmol·L-1)SCr(c/μmol·L-1)CCr(V/mL·min-1)对照组6.03±1.145.76±0.9671.17±10.850.26±0.06庆大霉素组24.42±10.6038.90±6.93404.25±77.210.15±0.03牛磺酸组9.55±3.0321.90±6.63183.25±98.920.21±0.04

    2.2  肾组织形态学观察

    2.2.1  光镜观察  庆大霉素组肾皮质内几乎全部近端小管上皮细胞出现广泛性坏死；牛磺酸组病变明显轻于庆大霉素组，出现上皮细胞坏死脱落的近端小管较少，尚可见完好的近端小管。对照组未见明显的病理改变。牛磺酸组的形态学分级均好于庆大霉素组，差异有显著性（Hc=31.374，P<0.001）。见表2。表2  各组大鼠肾组织形态学评分（例）组  别0级1级2级3级4级对照组120000庆大霉素组00138牛磺酸组02820

    2.2.2  电镜观察  庆大霉素组残留的近端小管上皮细胞出现核固缩；线粒体明显肿胀，线粒体嵴断裂、消失；溶酶体增多增大，并可见较多髓样小体形成；牛磺酸组近端小管上皮细胞病变较轻，细胞核无固缩，线粒体水肿较轻，线粒体嵴尚存，溶酶体数量及体积均明显减少。对照组近端小管上皮细胞超微结构无显著改变。

    2.3  ET1表达

    大鼠肾脏肾小球及血管的内皮细胞和系膜细胞及肾小管上皮细胞的胞浆中均有ET1表达。牛磺酸组皮、髓质肾小管上皮细胞胞浆内ET1的表达弱于庆大霉素组（Hc=26.317、22.364,P<0.001）。见表3。表3  各组大鼠ET1的表达

　　3  讨    论

    庆大霉素在治疗各种严重感染中发挥着重要作用，但是对于其毒性作用，尤其是肾毒性，我们亦不可忽视。本研究中，我们给大鼠腹腔注射庆大霉素100 mg/（kg·d）, 连续注射7 d，造成肾近端小管上皮细胞的严重损伤，引起肾功能损害，成功制备出急性肾损伤模型，这与以前文献报道相一致[5]。

    急性肾损伤的发病是多方面因素综合作用的结果。肾血流动力学调节异常学说认为，其产生是由于肾毒性物质的刺激引起ET等血管收缩活性物质分泌释放增多而引起[6，7]。肾脏中，除血管内皮细胞外，肾小管上皮细胞也能产生ET，肾脏分泌的ET通过自分泌和旁分泌作用与相应受体结合发挥多种病理生理学效应[6]。本实验显示，注射庆大霉素后，庆大霉素组肾小管上皮细胞尤其是髓质肾小管上皮细胞中ET1的表达明显增强，同时，肾功能和肾组织损伤显著加重，说明ET至少部分参与了庆大霉素引起的急性肾损伤的发生。

    牛磺酸能调节渗透压，结合胆酸调节中枢神经系统功能，并能防止氧化剂诱导的组织损伤，对心血管系统疾病、神经系统疾病具有一定的疗效[1]。近年来研究显示，其对肾脏亦有很好的保护作用。本实验中，光镜观察到庆大霉素作用后肾脏病变主要位于近曲小管，而肾小球、近直小管和远端肾单位在实验过程中的变化并不显著，与文献报道的近曲小管是庆大霉素的主要作用部位一致[6]。正常大鼠肾脏中，牛磺酸主要分布在髓质肾小管，近端小管只有少量存在[8]，这可能也是近端小管在庆大霉素肾中毒时损伤较重的原因之一。

    以前文献研究过程中大多将牛磺酸加入饮用水中，让大鼠自行饮用[9]，考虑到庆大霉素可引起食欲减退，且不同大鼠饮水习惯不同，从而对牛磺酸所起的作用可能估计过低。本实验采用腹腔注射的方法给药，由于所用溶液浓度较大，减少了肾衰竭时容量负荷过大对实验结果的影响。

    整体动物和离体组织实验显示，牛磺酸能拮抗ET引起的血压升高、血管收缩及促进血管平滑肌增殖等生物学效应，并能显著抑制低氧引起的ET合成及释放增加[9]。张梅等[11]研究显示，牛磺酸可使糖尿病大鼠血浆ET水平下降，尿ET排泄量也明显减少，升高的BUN及尿蛋白排泄量显著降低，提示牛磺酸可能通过抑制ET的产生和（或）释放，影响ET代谢或拮抗其生物学效应而使糖尿病肾病得以改善。

    本实验结果显示，应用牛磺酸后，大鼠肾功能明显改善，牛磺酸组大鼠的肾脏形态学表现亦明显好于庆大霉素组。提示牛磺酸对庆大霉素中毒的大鼠肾功能具有明显保护作用。同时，牛磺酸组大鼠肾组织中ET1的表达较庆大霉素组显著减弱，这说明牛磺酸抑制了肾脏ET1的合成、释放，从而减轻了庆大霉素肾毒性中ET1引起的血管收缩，改善了血流动力学状态，并减少了ET1对肾小管上皮细胞直接损伤作用。牛磺酸抑制ET1的机制尚未完全阐明，可能与其调节细胞内钙离子浓度，抗脂质过氧化以及抑制血管紧张素Ⅱ等作用也有关。

    牛磺酸可抑制肾组织中ET1的生成，从而对庆大霉素引起的急性肾损伤起到保护作用，但其保护作用并不完全，牛磺酸组大鼠的肾功能指标及形态学改变与对照组比较仍有显著差异，这可能是由于庆大霉素中毒性急性肾损伤是多因素综合作用的结果，而牛磺酸只能对其中一个或几个因素起到抑制作用，急性肾损伤的防治须从多方面考虑。

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作者单位：青岛大学医学院附属医院病理科，山东 青岛 266003