全颅常规外照射对大鼠血脑脊液屏障上Pgp和MRP1表达的影响及意义

【摘要】  目的 探讨全颅常规外照射对大鼠血脑脊液屏障上多药耐药相关蛋白P糖蛋白（Pgp）、MRP1表达的影响及其临床意义。方法 将50只正常成年雄性Wistar大鼠随机分为5组,分别采用0（对照组）、10、20、30、40 Gy 的60Co γ射线进行全脑常规分割外照射, 每次2 Gy、1野/次,5次/周。各组完成照射计划后16 h断头取脑,40 g/L中性甲醛固定24 h,石蜡包埋，制备组织切片。采用免疫组化法检测各组大鼠血脑脊液屏障上Pgp和MRP1的表达情况。结果 对照组Pgp阳性表达最强,照射10、20、30 Gy时，其表达减弱，30 Gy时最弱，40 Gy时Pgp表达又有所增强，20、30、40 Gy组与对照组比较，差异有显著性（F=8.18，q=4.496～6.670,P<0.05）；10 Gy组与20、30、40 Gy组比较，差异有显著性（q=3.371～5.551,P<0.05）。MRP1在对照组有微弱表达，随着照射剂量的增加其表达有所增强，40 Gy组与其他各组间比较，差异有显著性（F=11.14，q=2.560～7.657，P<0.05）。结论 一定剂量的放射线主要是通过降低血脑脊液屏障上Pgp的表达,增加血脑脊液屏障的通透性发挥作用，并且在放射剂量达到20 Gy时化疗效果最好。

【关键词】  多药耐药相关蛋白类；P糖蛋白；血脑屏障；放射疗法；颅脑照射

  
　　THE INFLUENCE OF WHOLEBRAIN EXTERNAL IRRADIATION ON EXPRESSION OF PGLYCOPROTEIN AND MULTIDRUG RESISTANCEASSOCIATED PROTEIN ONE AT BLOOD BRAIN BARRIER

　　QI CAIXIA, AN YONGHENG

　　(Department of Oncology, The Affiliated Hospital Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of wholebrain external radiation on expression of Pglycoprotein (Pgb) and multidrug resistanceassociated protein one (MRP1) in blood brain barrier (BBB) in rats. Methods Fifty adult male Wistar rats were divided randomly, based on different doses of 60Co given, into five groups: 0 (control group), 10, 20, 30, and 40 Gy. All were exposed to conventional fractionation (2 Gy/d,5 d/w) with γray and killed and brain collected 16 hours after irradiation and Pgp and MRP1 at BBB detected by SP immunohistochemistry. Results  Pgp expression was the highest in group  0 Gy, the expression decreased with the increase of radiation dose,but it increased somewhat when the dose reached 30 Gy. Compared with group 0 Gy,the difference between grops 20,30, and 40 Gy was significant (F=8.18,q=5.446,6.670,4.496;P<0.05); the expression of MRP1 was weak, but became stronger with the radiation dose increased. The difference between group 40 Gy and the other groups was significant (F=11.14,q=3.360,P<0.05). Conclusion A certain dose of radiation can decrease the expression of Pgp through BBB, increase drug permeability,to produce its effect. The best chemotherapeutic outcome is obtained when the dose reaches 20 Gy.
   
　　［KEY WORDS］ Multidrug resistanceassociated proteins; Pglycoprotein; Blood brain barrier; Radiotherapy; Cranial irradiation
   
　　中枢神经系统肿瘤对大多数化疗药物不敏感,以往认为是由于血脑脊液屏障存在阻碍药物进入肿瘤细胞。近年来分子生物学研究发现，颅内肿瘤产生耐药性的机制是多方面的，其中以多药耐药（MDR）最为常见[J]。血脑脊液屏障上有多种MDR基因编码的药物转运蛋白,如P糖蛋白(Pgp)、MDR性相关蛋白(MRP)、肺癌耐药性蛋白(BCRP)等，其中Pgp与血脑脊液屏障的关系最为密切[2，3]。 Pgp参与大量结构与功能各异药物的脑内转运,是ATP依赖性的药物外排泵,能将细胞内的药物泵出细胞膜外,从而降低细胞内药物浓度，在保护脑组织免受有害物质的侵袭的同时也降低了化疗药物在脑内的浓度。MRP1同样是由MDR基因编码的多药耐药相关蛋白,其在血脑脊液屏障上的功能与 Pgp相似。RTPCR 与 Western印迹法分析证明，MRP1存在于脉络丛上皮细胞上的基膜,而其是否存在于血脑脊液屏障的血管内皮细胞上还存在争议。 临床及动物实验研究证明，放射线可以降低血脑脊液屏障的功能,增加其对化疗药物的通透性[4]。本实验观察不同剂量放射线对血脑脊液屏障上Pgp和MRP1表达的影响,为解释放射线增加血脑脊液屏障通透性提供病理学依据,也为颅内肿瘤放化疗的序贯性和最佳化疗时机提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  动物  正常成年雄性Wistar大鼠50只(由青岛市药物研究所提供),体质量190～310 g,平均257 g。

　　1.1.2  试剂  兔抗鼠Pgp单克隆抗体(工作浓度1∶200),兔抗鼠MRP1多克隆抗体(工作浓度1∶50)均购自武汉博士德生物技术有限公司;EDTA抗原修复液,通用型两步法试剂盒,DAB显色剂,非免疫动物封闭兔血清均购自福州迈新生物技术有限公司。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物分组  将50只大鼠随机分为5组,即0（对照）、10、20、30、40 Gy组,每组10只。

　　1.2.2  照射方法  大鼠均经水合氯醛麻醉后俯卧位固定于治疗床上,经模拟定位后进行全脑外照射：采用  60Co γ射线,源皮距75 cm,照射野约2.5 cm×2.5 cm,上界位于双眼后眦连线,下界位于双耳后连线,左右露空，垂直照射，每次2 Gy,1野/次,5次/周。每组每次同时照射4只,照射结束后同一饲养条件下饲养。

　　1.2.3  样本采集及制备  照射计划完成后16 h,立即断头取脑,40 g/L中性甲醛固定24 h后,石蜡包埋,制备4 μm厚的石蜡切片。

　　1.2.4  Pgp和MRP1表达的检测  采用免疫组化SP法。石蜡切片常规脱蜡水化后,磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗,EDTA抗原修复。加体积分数0.10 H2O2室温下孵育10 min，PBS冲洗。检测Pgp的切片加50 μL的Pgp单克隆抗体,置于室温下孵育60 min;检测MRP1的切片加非免疫动物封闭兔血清,室温下孵育20 min,后加50 μL MRP1多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜;阴性对照用PBS代替一抗。用PBS冲洗,每张切片滴加生物素标记的二抗,室温下孵育10～15 min;PBS冲洗后DAB显色,苏木精复染,封片。

　　1.2.5  阳性结果判断标准  在40倍显微镜下观察，毛细血管内皮细胞的细胞膜和细胞浆中出现棕黄色颗粒状染色为阳性。高倍镜下每一切片取5个视野，每个视野各计数100个细胞，计数阳性细胞数，同时测累计吸光度值（A），判断血管内皮细胞上Pgp及MRP1的表达情况。

　　1.3  统计学分析
   
　　采用IPP 6.0分析系统进行图像分析。采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析。

　　2  结果

　　2.1  血脑脊液屏障上Pgp的表达
   
　　对照组Pgp表达最强,随着照射剂量增加,其表达不同程度减弱,30 Gy时表达最弱,当剂量达到40 Gy时表达略有增强。 20、30、40 Gy组与对照组比较，差异有显著性(F=8.18,q=4.496～6.670,P<0.05）；10 Gy组与20、30、40 Gy组比较，差异有显著性(q=3.371～5.551,P<0.05）。见表1。Pgp表达A值检测结果大致与阳性细胞检测结果相似,其不同在于,20 Gy组与30 Gy组及40 Gy组相比较，差异亦有极显著意义（F=166.96，q=6.784、17.141,P<0.01）。见表2。

　　表1  各组Pgp和MRP1表达阳性细胞数比较（略）

　　与对照组比较，F=8.18、11.14,*q=4.496～7.656,P<0.05;与10 Gy组比较，△q=3.371～7.602,P<0.05;与20 Gy组比较,#q=3.250、2.564,P<0.05;与30 Gy组比较，☆q=3.360,P<0.05
   
　　表2  各组A值比较（略）

　　与对照组比较,F=166.96、66.31，*q=19.651～29.063,P<0.01;与10 Gy组比较，△q=18.517～26.185,P<0.01;与20 Gy组比较，＃q=6.784、17.141,P<0.01;与30 Gy组比较,☆q=7.330、16.820,P<0.01

　　2.2  血脑脊液屏障上MRP1的表达
   
　　对照组MRP1表达微弱,随着照射剂量的不断增加,MRP1的表达逐渐增强,40 Gy时表达最强。40 Gy组与其他各组比较差异有显著性(F=11.14，q=2.560～7.656，P<0.05)。见表1。MRP1表达A值检测结果与阳性细胞检测结果大致相似，40 Gy组与其他各组相比较，差异有显著意义(F=66.31，q=16.820～18.524，P<0.01)。见表2。

　　3  讨论
   
　　颅内肿瘤的发病率呈上升趋势，合理的综合治疗对于提高颅内肿瘤治疗的有效率具有重要意义。本研究采用常规照射方法,观察不同射线剂量对大鼠血脑脊液屏障上Pgp及MRP1表达的影响，结果显示, Pgp在正常大鼠血脑脊液屏障上大量表达,而当接受不同剂量照射时,其表达有不同程度的降低,在接受20 Gy射线照射时Pgp表达明显降低，30 Gy时达到最低。这与MIMA等[5]的动物实验结论相同。但当照射剂量达到40 Gy后，Pgp表达略有增强，这可能是由于大剂量放射线诱导了Pgp的表达。正常情况下，MRP1在大鼠血脑脊液屏障上未见明显表达,在接受40 Gy放射线照射时可见其呈弱阳性表达。虽然放射线在一定程度上诱导了MRP1的表达，但由于MRP1在血脑脊液屏障上并不起主要作用，因此，我们可以认为放射线通过降低血脑脊液屏障上主要多药耐药蛋白Pgp的表达,增加血脑脊液屏障的通透性,而且在20～30 Gy时降低最明显,故照射剂量20～30 Gy的时候是加用化疗，采取同期放化疗的最佳时机。当然，我们在颅内肿瘤治疗上不仅要把握治疗时机,放射线的剂量把握也是十分重要的,许多病人不是死于肿瘤,而是死于放射性损伤[6]。
   
　　关于放射线是否诱导多药耐药相关蛋白的表达,目前文献报道不多，结论也不一致。有实验结果表明，对体外培养细胞进行外照射可增强MDRI mRNA及其蛋白的表达，产生耐药；也有一些研究结果相反，对细胞使用中低剂量外照射可使细胞耐化疗、耐凋亡基因表达降低，使其后化疗更敏感。其产生机制可能是：由于射线的直接作用使DNA发生单链或者双链的断裂，基因发生突变；通过电离产生间接作用可以激活、活化细胞基因表达和改变细胞周期信号转导等。某些基因上调及下调，影响细胞周期进程及“关卡”的通过及停滞，从而引起细胞的增殖及分化、存活及死亡等一系列的生物学改变。其中可能会涉及到是否产生MDR有关的因素。ANDERSSON 等[7]研究结果显示，大鼠脑胶质细胞株和鼠脑血管内皮细胞(RBE4)体外X 线照射后，血管内皮细胞钙泵活动增强而胶质细胞不增加；大鼠脑胶质模型BT4C经X线照射后，耐药蛋白在毛细血管内皮细胞和周围正常脑细胞都有Pgp 的过度表达，肿瘤细胞中未见Pgp 过度表达。HILL[8]研究显示,对细胞使用中低剂量外照射可降低细胞耐化疗、耐凋亡基因的表达, 其结果是使其后的化疗更加敏感。DUMITRIU等[9]用960 mJ/cm2紫外线和50 Gy X线照射外周血PBL 淋巴细胞,结果显示，其可剂量依赖性地阻止ABC 载体的外排功能。总之,对于放疗是否产生耐药的问题尚无一致的结论。本文实验结果显示，放射线在很大程度上降低了Pgp的表达,进而降低了血脑脊液屏障的功能,增加了血脑脊液屏障对化疗药物的通透性,为放射线可以损害血脑脊液屏障的功能提供了病理学依据。

【参考文献】
  　　[1]贺昭忠,吴承远. 脑胶质瘤多药耐药基因表达及其对化疗药物敏感性[J]. 齐鲁医学杂志, 2002,17(2):98100.

　　[2]王冰,潘彦舒,李澎涛. 血脑脊液屏障上的药物转运体P糖蛋白[J]. 现代生物医学进展, 2007,17(1):115119.

　　[3]BEAULIEU E, DEMEULE M, GHITESCU L. Pglycoprotein is strongly expressed in the luminal membrances of the endothelium of blood vessels in the brain[J]. Biochem J, 1997,326:539544.

　　[4]CACCIARDLO R, RUSSI E, ALBIERO F, et al. Cerebral metabolism and permeability of the hematoencephalie barrier in al1 experimental modd fobrain radiotherapy[J]. Redid Med, 1990,80:7097l2．

　　[5]MIMA T, TOYONAGA S, MORI K, et al, Early decrease of Pglycoprotein in the endothelium of the rat brain capillaries after moderate close of irradiation[J]. Neurol Res, 1999,21(2):121.

　　[6]李文健,裴海涛. 放射性脊髓病临床研究进展[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(4):371373.

　　[7]ANDERSSON U, GRANKVIST K, BERGENHEIM A T. Papid induction of longlasting drug efflux activity in brain vascular endothelial cells but not malignant glioma following irradiation[J]. Med Oncol, 2002,19:19.

　　[8]HILL B T. Evidence of differential regulation of Pgpcoprotein overexpressing in drugresistance tumer cells selected by exposure to Xirradiation as opposed to antitumour drugs[J]. Onkologie, 1996,19(S1):69.

　　[9]DUMITRIU I E, ROEDEL F, BEYER T D, et al. UV or Xirradiation increases the eytoplasmic accumulation of rhodamine 123 in various cancer cell lines[J]. Strahlenther Onkol, 2003,179:564570.

作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003