HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织HBV DNA检测

【摘要】  目的 通过检测乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织中HBV DNA，探讨HBV可否感染人类卵巢组织细胞，为HBV经生殖细胞垂直传递感染提供实验依据。方法 自20例HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织蜡块中提取DNA，应用聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交(FISH)方法检测卵巢肿瘤病人卵巢组织细胞中HBV DNA。以20例HBsAg阴性卵巢肿瘤病人卵巢石蜡组织作为对照。结果 HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织存在HBV DNA，与对照组比较，差异有极显著意义（χ2=24.000、21.539,P<0.01）。结论 HBV可以感染卵巢组织细胞，HBV有可能通过卵细胞进行垂直传播。

【关键词】  卵巢肿瘤 肝炎病毒 乙型 原位杂交 荧光 聚合酶链反应 疾病传播 垂直

　　DETECTION OF HBV DNA IN THE OVARIAN TISSUE OF HBsAgPOSITIVE PATIENTS WITH OVARIAN TUMORS
　　ZHANG ZHE, WANG PEILIN, WANG CHONG

　　Department of Genetics, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China

　　［ABSTRACT］ Objective To detect if there is hepatitis B virus (HBV) DNA in the ovarian tissue of the Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)positive patients with ovarian tumors, whether HBV could infect human ovarian tissue and germ cells causing vertical transmission.   Methods Polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH) were used to detect HBV DNA in the ovary paraffin sections of the patients with ovarian tumors. Results HBV DNA existed in the ovarian tissue cells of the HBsAgpositive patients with ovarian tumors and no HBV DNA was detected in the HBsAgnegative control group patients. Difference in the HBV DNA existence between these two groups was significant (P<0.01).  ConclusionHBV could infect ovarian tissue and transmit vertically by infecting germ cells.

    ［KEY WORDS］ Ovarian neoplasms; Hepatitis B virus; In situ hybridization, fluorescence; Polymerase chain reaction; Disease transmission, vertical

    目前，在我国的乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）携带者有1.2亿，其中40%由母婴传播所致[1，2]。因此，HBV母婴传播的途径得到广泛关注，其中证明HBV垂直传播的途径和分子生物学机制对控制人群HBV感染率具有十分重要的意义。     

　　本研究分别应用聚合酶链反应（PCR）、荧光原位杂交(FISH)技术检测HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织中HBV DNA，以期为HBV可经卵细胞垂直传播提供依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  标本 

　　标本来源于青岛市市立医院妇产科手术切除的卵巢组织，取20例HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢石蜡组织为实验组，病人年龄34～53岁，平均41岁；取20例HBsAg阴性卵巢肿瘤病人卵巢石蜡组织为对照组，病人年龄30～50岁，平龄39岁。

　　1.1.2  试剂 

　　DNA提取试剂盒、PCR试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。PCR引物：引物1位于HBV DNA正链的1 980～1 999区，长度20 bp，序列为5′ATGGAGAACACAACATCAGG3′；引物2位于HBV DNA负链的2 641～2 657区，长度17 bp，序列为5′AATGTATACCCAAAGAC3′，扩增产物长678 bp。引物1、2由上海生工生物工程技术公司合成。原位杂交试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，HBV DNA探针位于HBV DNA正链的2 227～2 256区，长30 bp，序列为5′TCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCT3′。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PCR扩增 

　　卵巢石蜡标本脱蜡，然后按照试剂盒说明书提取DNA。25 μL PCR反应体系包括：DNA提取物2.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，引物1、2(10 μmol/L)各1 μL,去离子水8 μL。反应条件：94 ℃预变性10 min；然后94 ℃ 40 s、60 ℃40 s、72 ℃ 1 min，共循环35次；最后72 ℃ 延伸10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.2  FISH 

　　卵巢组织切片脱蜡后，按照原位杂交试剂盒说明书制备组织切片标本，然后在荧光显微镜下观察。

　　1.2.3  统计分析
 
　　应用SPSS 11.5统计软件,组间数据比较采用Pearson卡方检验。

　　2  结 果

　　2.1  两组目的片段PCR检测

    PCR扩增产物片段长度为678 bp（图1）。实验组20例卵巢组织中，15例检测到HBV DNA片段；对照组20例卵巢组织中均未检测到HBV DNA片段，两组比较差异有极显著意义（χ2=24.000,P<0.01）。

　　2.2  两组HBV DNA FISH检测

    实验组20例卵巢组织中有14例在卵泡、间质细胞及血管周围可见黄绿色荧光着色，显示有HBV DNA存在；对照组20例卵巢组织均未见黄绿色荧光着色。两组HBV DNA检出率比较差异有显著性（χ2=21.539,P<0.01）。

　　3  讨论

    目前普遍认为，HBV经母婴垂直传播的方式有宫内感染、产道传播、产后传播和生殖细胞传递等[3,4]。多项研究表明，HBV有可能通过感染生殖细胞并经过受精传染子代[5]。由于实验取材的限制，以鼠或人类精子作为HBV载体对HBV经雄性生殖细胞的垂直传播研究较多[6]，而以卵细胞为HBV垂直传递载体，经受精使子代获得HBV DNA的研究报道较少，且多局限于动物实验。张清健等[7]将小鼠卵母细胞与pBR322HBV重组质粒进行共培养后,证实卵子的透明带不能成为阻挡HBV进入的屏障,HBV DNA能够通过它们和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到染色体上。陈桂兰等[8]将pBR322HBV重组质粒注射入小鼠卵巢后，其子代胚胎中检测到HBV DNA。但是对于HBV感染的女性病人，HBV如何感染卵巢及卵细胞，经受精使子代获得HBV DNA研究极少[9]。

    由于HBV并非专一嗜肝病毒，许多肝外组织均可检出HBV DNA[10]，使得HBV感染卵巢成为可能。据报道HBsAg存在于卵巢颗粒细胞和卵巢间质细胞中，定位于胞膜和胞浆[11]，而且HBsAg是临床上检测HBV感染的主要指标[12]。本实验为探讨HBV感染卵巢组织及卵细胞的可能性，采用了PCR和FISH技术，这两项技术均能从细胞中检出极为微量的HBV DNA，同时实验材料选取了卵巢肿瘤病人的卵巢石蜡组织，克服了难以直接以人类卵巢组织为实验对象的取材问题。FISH检测结果显示,实验组14例样本检测到HBV DNA，阳性率为70%，HBV DNA分别分布于卵泡细胞、血管管壁及间质细胞；对照组均未检测到HBV DNA，两者HBV DNA检出率比较差异有极显著性。YE 等[13]对HBV慢性感染妇女卵巢的研究结果显示，HBV DNA在卵巢组织的间质细胞、颗粒细胞中也部分呈阳性，与本实验结果一致。同时，本文用PCR技术检测HBsAg阳性卵巢肿瘤病人卵巢组织中HBV DNA结果表明，其中15例病人检测到HBV DNA，阳性率为75.5%，在HBsAg阴性卵巢肿瘤病人卵巢组织中，未检测到HBV DNA，两者差异高度显著。实验中FISH和PCR检测的HBV DNA阳性率基本一致，证实HBV可以感染卵巢组织。

    本文实验结果表明，HBV可以感染卵巢组织，HBV DNA可以整合进人类的基因组中。本研究结果为HBV感染通过卵细胞的垂直传播提供了实验依据。但是HBV感染卵巢及卵细胞是一个复杂过程，对其感染机制还应进行更深一步的研究。

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　　[8]陈桂兰,黄天华,谢庆东,等. 卵母细胞携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达[J]. 癌变·畸变·突变, 2005,17(3)：179182.

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　　[12]徐立文,王淑芬. 乙型肝炎HBVDNA与HBV血清标志物的相关性[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):161.

　　[13]YE F, YUE Y, LI S, et al. Presence of HBsAg, HBeAg, and HBVDNA in ovary and ovum of the patients with chronic hepatitis B virus infection [J]. Am J Obstet Gyneeol, 2006,194 (2)：387392.

作者单位：青岛大学医学院遗传学研究室，山东 青岛 266021