常压高浓度氧环境对早产大鼠脑损伤的影响

【摘要】  目的 观察常压高浓度氧（NH）对早产大鼠脑组织病理学改变及脑组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，探讨NH对未成熟大鼠脑损伤的影响及其作用机制。方法 取21 d早产新生Wistar大鼠192只，于生后12 h随机分为对照组（空气吸入)、NH 1组（吸入体积分数0.30氧气）、NH 2组（吸入体积分数0.60氧气）和NH 3组，（吸入体积分数0.95氧气），每组48只。NH 1组、NH 2组和NH 3组于NH环境养育72 h，各组分别于吸氧结束后第0、3、5和10天灌注取脑组织，在光镜下观察其病理改变，并分别测定脑组织匀浆中MDA含量和SOD活性的变化。结果 与对照组、NH 1组比较，NH 2组、NH 3组光镜下脑组织均可见神经元变性和脑组织水肿，NH 3组可见明显胶质细胞反应,且NH 3组脑损伤程度较NH 2组加重。对照组和NH1组各时间点的MDA含量和SOD活性比较差异无显著性（P>0.05）。NH 2组、NH 3组吸入NH后脑组织MDA含量升高,SOD活性下降,吸氧结束后第0、3、5天的MDA含量、SOD活性与对照组和NH 1组比较差异均有显著性（F=93.91～786.97，q=4.82～53.50，P<0.01)。第10天 NH 3组与对照组和NH 1组、NH 2组比较MDA含量、SOD活性差异均有显著性（F= 4.03～5.26，q=0.80～5.05，P<0.05、0.01）。结论 持续吸入NH可能引起早产大鼠脑损伤，适当控制吸氧浓度和时间有助于减少脑损伤的发生，减轻脑损伤的程度。

【关键词】  氧 脑损伤 超氧化物歧化酶 丙二醛 大鼠 Wistar

　　HYPEROXIAINDUCED BRAIN INJURY IN PREMATURE RATS

　　ZHAO XIUXIA, JIANG HONG

　　Department of Neonatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College Qingdao 266003, China

　　［ABSTRACT］ Objective To explore the dynamic effect of normobaric hyperoxia on survival situation and morphologic characteristics in premature rats. Methods This study consisted of 192 immature rats，born at a gestational age of 21 days, which were randomly exposed to oxygen (30%O2, group 1), oxygen (60%O2, group 2), oxygen (95%O2, group 3), or room air. Brain histology after hematoxylin eosin stain and the contents of MDA, enzyme activity of SOD in cerebral tissue were measured on day 0, 3, 5, and 10 after oxygen exposure in three hyperxia groups and air controls. Results Compared with the controls and hyperxia group 1 neuronal degeneration and edema were seen in early stage, and were aggravated at three days after oxygen exposure. MDA increased with ages, while MDA decreased at five days then regained to normal level. And SOD decreased at day 0, which were aggravated significantly at three days and then regained to normal level at 10 days, compared with air group and hyperxia group 1 (F=93.91-786.97,q=4.82-53.50,P<0.01). And compared with air group and hyperxia group 1, hyperxia group 2 at 10 days, MDA increased and SOD decreased of hyperxia group 3 (F=4.03-5.26,q=0.80-5.05,P<0.05,0.01). Conclusion Persistent breathe in highest oxygen may cause brain injury in immature rats. Appropriate oxygen concentration and reasonable exposure time is beneficial to the decrease and relief of the damage.

    ［KEY WORDS］ Oxygen; Brain injury; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Rats, Wistar

    随着围产医学的发展，早产儿的存活率不断提高，氧疗及机械通气是早产儿各种缺氧性疾病必不可少的治疗手段之一，其中常压高浓度氧（NH）应用较广泛。国内外许多研究证实，NH在治疗同时会造成新生儿肺、脑和视网膜的损伤。关于NH对脑损伤的研究较少，且已有的研究多针对新生足月动物，目前尚缺乏关于NH对早产未成熟动物脑损伤的实验研究。本课题旨在通过观察早产新生鼠长时间吸入NH后，其脑组织的病理改变以及丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性变化，以探讨NH对未成熟大鼠脑损伤的影响和活性氧在脑损伤中的作用机制，为早产儿临床氧疗防止NH性脑损伤提供依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物及分组

    Wistar成年雌雄大鼠64只，体质量约250 g，由青岛市实验动物中心提供，按雌雄3∶1合笼交配，次日晨检见阴道栓者当日记为妊娠第1天，于孕鼠妊娠第21天行剖宫产，取出成活新生早产鼠192只，平均体质量(4.82±0.13)g,雌雄不限，随机分为对照组（空气吸入) 、NH1组（吸入体积分数0.30氧）、NH 2组（吸入体积分数0.60氧）和NH 3组（吸入体积分数0.95氧），每组48只。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  NH实验 

　　NH 1组、NH 2组、NH 3组早产鼠与代乳鼠一起置于常压氧箱中饲养，持续输入氧气，数字式测氧仪检测下调控箱内氧浓度，使NH 1组箱内氧体积分数为0.30，NH 2组氧体积分数为0.60，NH 3组箱内氧体积分数为0.95。用钠石灰使CO2体积分数低于0.005，温度25～28 ℃，湿度在50%～70%，每日开箱0.5 h，更换饲料、水。对照组置于室内空气（氧体积分数0.21）养育，具体方法及实验控制因素同各NH组。各NH组于相应氧浓度下暴露72 h后放置于空气中继续饲养。每日观察并记录各组早产鼠的一般情况，死亡率，生活行为等。

　　1.2.2  脑组织病理观察 

　　4组早产鼠分别于NH或空气暴露72 h结束后第0、3、5、10天随机取6只，灌注并取脑组织作苏木精伊红（HE）染色后，光镜下观察脑组织病理变化。

　　1.2.3  脑组织MDA含量、SOD活性测定
 
　　4组早产鼠分别于NH或空气暴露72 h结束后第0、3、5、10天同时分别随机取6只，取新鲜脑组织，于海马区各取0.5 g切碎，于冰盒内超声粉碎匀浆，制成质量浓度100 g/L匀浆液，4 ℃低温离心后取上清液，分别通过硫代巴比妥酸缩合反应和黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应完成MDA含量及SOD活性的检测。具体操作严格按试剂盒说明书进行。

　　2  结 果

　　2.1  新生早产鼠存活情况

    NH 2组、NH 3组于氧气暴露结束0～3 d均出现少动,反应差，呼吸较促,皮肤苍白,光泽渐失，皮下脂肪菲薄。于5～7 d恢复，但均未出现惊厥、瘫痪等异常行为。而对照组和NH 1组无以上异常表现。各组均未有新生早产鼠死亡。

　　2.2  新生早产大鼠脑组织病理形态学变化

　　2.2.1  脑大体检查 

　　NH 1组各时间点处死的大鼠脑外观与对照组相比无明显差异。NH 2组表现为充血、水肿，NH 3组表现为明显充血、水肿。

　　2.2.2  HE染色光镜观察结果 

　　NH 2、NH 3组均可见不同程度脑组织水肿，神经元出现变性。病变主要累及大脑皮质,呈层状、灶状改变,外侧较内侧改变明显；海马的CA3区和齿状回改变轻微；小脑受累不明显；其他部位如新纹状体、苍白球、丘脑、黑质、红核均未见异常改变。NH 2组吸氧结束后第0天表现为胞浆呈均匀的粉红色嗜酸性染色,细胞皱缩,部分细胞胞核深染,核仁不清，可见胶质细胞反应性增生。未见崩解细胞和吞噬细胞,神经元无脱失。第3天时严重变性的细胞数量增多,病变范围达高峰,但水肿消退。第5天后细胞变性程度及病变范围均趋于减轻，至第10天时基本恢复正常。NH 3组与NH 2组相比，病变更为显著, 严重变性的细胞数量明显增多，病变广泛累及大脑皮质，可见明显胶质细胞反应。NH 1组可见少数神经元变性，对照组偶见变性细胞，NH 1组与对照组无明显差异。

　　2.3  各组脑组织SOD的活性及MDA的含量的动态变化

    对照组和NH 1组各时间点的MDA含量和SOD活性比较差异无显著性（P>0.05）。NH 2组、NH 3组吸入NH后脑组织MDA含量升高,SOD活性下降,吸氧结束后第0、3、5天的MDA含量、SOD活性与对照组和NH 1组比较差异均有显著性(F=93.91～786.97，q=4.82～53.50，P<0.01)。第10天 NH 3组与对照组和NH 1组、NH 2组MDA含量、SOD活性比较，差异均有显著性(F=4.03～5.26，q=0.80～5.05，P<0.05，0.01)。见表1、2。表1  各组脑组织匀浆SOD活性动态变化比较(略)表2  各组脑组织匀浆MDA含量的动态变化（略)

　　3  讨论

    随着围产医学的发展，早产儿的存活率不断提高，常压NH救治早产儿各种缺氧性疾病得到较广泛应用。许多研究证实,NH在治疗的同时会造成机体器官的NH性损伤，肺、脑和视网膜是最易受伤的器官[1～3]。在早产儿尤其是极低、超低出生体质量儿中，NH性脑损伤可能是神经系统永久性功能性障碍的重要原因之一，更应引起足够的重视。本实验成功地建立了NH脑损伤模型，结果表明NH暴露可诱发新生早产鼠急性脑损伤，暴露氧体积分数越高脑损伤越重，与有关报道一致[1,4]。

    有研究结果证实，脑发育不成熟、氧化应激及炎症损伤在脑损伤的发生发展中起重要作用 [4～10]。动物实验证明，组织处于高氧状态时自由基含量是增高的，且随着暴露时间的延长增加更显著[6]。目前认为NH的毒性作用主要是由氧自由基引起的。NH可以直接刺激线粒体电子传递过程,产生过量的自由基，自由基性质十分活跃且极不稳定,易氧化细胞膜中不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化反应。在正常生理状态下，机体同时存在抗氧化机制，防止自由基的损伤。氧自由基产生过多或机体清除氧自由基的酶活性不足均会使脑组织受到损害。大鼠出生后3～7 d可能是神经发生的另一高峰，对NH非常敏感，暴露NH环境中，早产鼠与足月鼠相比，不能诱导其体内抗氧化酶系统(AOE)的生成,其体内AOE活性相对或绝对不足可能是易发生高氧脑损伤的重要原因。本实验亦证明，长时间NH环境的暴露可致新生早产鼠脑损伤，其病理变化的形式主要为细胞的变形坏死。

    SOD是机体内非常重要的氧自由基清除剂,对机体的氧化与抗氧化平衡起着极其重要的作用。MDA作为自由基的降解产物,也是自由基水平测定的一个指标[8,9,11]。本实验结果表明,随着NH暴露时间的延长，MDA明显升高，SOD活性相应的下降，以NH暴露后第3天改变最明显，差异有显著性意义，且随着氧体积分数的升高其变化更著，说明持续NH暴露的新生大鼠脑组织存在自由基过量产生和脂质过氧化反应,提示自由基对NH性脑损害的形成有一定的作用，与氧体积分数相关。同时，第5天MDA、SOD活性水平呈恢复趋势，第10天则与NH暴露前比较差异无统计学意义，说明停止吸氧后病情可在一定程度上恢复，但是NH 3组第10天未恢复，提示持续吸入NH的时间过长，浓度过高，可造成不可逆转的脑损伤。

    本实验研究结果表明,早产大鼠持续NH暴露可致脑损伤，NH通过降低未成熟机体自由基清除酶的活力，产生过量自由基，引起脂质过氧化反应，导致脑组织细胞损伤的发生，且损害程度与氧体积分数呈正相关。适当控制吸氧浓度和时间有助于减少脑损伤的发生，减轻脑损伤的程度，此为早产儿临床氧疗防止NH脑损伤提供了依据。

【参考文献】
  　　[1]袁莉. 高氧性肺损伤的研究进展[J]. 国外医学:麻醉学与复苏分册, 2003,24(3): 184187.

　　[2]许峰,霍泰辉,翁颂铭. 高氧对早产鼠和成熟鼠肺损伤的研究[J]. 实用儿科临床杂志, 2001,16(2):6970.

　　[3]戈平,姜毅. 常压高浓度氧对正常新生大鼠脑组织的影响[J]. 中华儿科杂志, 2000,38(6):390391.

　　[4]孟卫霞,钱燕. 高氧与新生儿脑损伤[J]. 浙江医学, 2007,29（5）:506507.

　　[5]ROBERTO S, ARTURO O. Hyperoxia with 100% oxygen following hyperoxiaischemia increases brain damage in newborn rats[J]. Biology of the Neonate, 2005,88:168171.

　　[6]XU F, FOK T F, YIN J. Hyperoxia induced lung injury in premature rat: description of a suitable model for the study of lung diseases in newborns [J]. Clin Med J, 1998,111(7):619624.

　　[7]HE Y Z, CHEN C. Changes of IGF1 andits receptor in 3 day old premature rats with chronic hypoxicischemic brain damage[J]. Chin J Contemp Pediatr, 2005,7(3):193197.

　　[8]FELDERHOFFMUESER U, BITTIGAU P, SIFRINGER M, et al. Oxgen causes cell death in the developing brain[J]. Neurobiology of Disease, 2004,17:273282.

　　[9]YESHIN H, MARGARET S, JAMES D. Antioxidant enzyme expression in rat lung during hyperoxia[J]. Am J Physiol, 1996,270:L810L818.

　　[10]SAUGSTAD O D, RAMJI S, VENTO M. Resuscitation of depressed newborn infants with ambient air or pure oxygen: a metaanalysis[J]. Biol Neonate, 2005,87:2734.

　　[11]MUNKEBY B H, BORKE W B, BJORNLAND K, et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets[J]. Pediatr Res, 2004,56:783790.

作者单位：青岛大学医学院附属医院新生儿科，山东 青岛 266003