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【摘要】 目的 构建诺瓦克病毒核酸片段克隆。方法 选取诺瓦克病毒阳性标本，应用 RT-PCR方法扩增目标片段，将其克隆到质粒，通过酶切、测序鉴定。结果 成功构建诺瓦克病毒核酸片段克隆。结论 成功地获得了可作为核酸检测阳性对照的诺瓦克病毒核酸片段克隆，为该病毒的分子生物学检测和进一步研究奠定了基础。
【关键词】 诺瓦克病毒 克隆 分子 逆转录聚合酶链反应
诺瓦克病毒是成人病毒性腹泻的主要病原体，广泛存在于牡蛎等海鲜品中，主要通过粪-口途径传播［１］。目前，诺瓦克病毒的检测方法有ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR等，但由于诺瓦克病毒现在仍然无法体外培养，因此，这些检测方法的阳性对照目前主要采用来自病毒感染者的带毒标本。这种阳性对照存在着多种缺陷，如不能满足提高检测方法准确性的要求，特别是实时荧光RT-PCR，标准的定量的阳性对照是必需的。本研究通过分子生物学方法，将诺瓦克病毒的ORF1-ORF2保守核酸片段克隆到载体上，构建重组质粒，便可作为上述核酸检测方法的阳性对照；如果进一步将此重组克隆表达，还可用于诺瓦克病毒ELISA方法的建立。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
QIAamp mini viral RNA kit购自Qiagen公司；RT-PCR kit购自Promega公司；连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；引物由上海基康生物有限公司合成；感受态细胞购于东正汇东生物公司；毒株分离自中国疾病预防控制中心提供的诺瓦克病毒检测阳性的粪便悬液。
1.2 方法
1.2.1 病毒RNA的提取 腹泻标本以12 000 r/min离心10 min后，取上清140 μL按照试剂盒说明书提取诺瓦克病毒核酸RNA。
1.2.2 诺瓦克病毒阳性片段的获得 参照文献［2］在ORF1-ORF2处设计引物，上游引物：5′-GAATTCTGACGATTTCATCATCCCCGTC-3′，下游引物：5′-CTCGAGGATTACTCCAGGTGGGACTC-AAC-3′， 5′端分别引入EcoR Ⅰ和Xoh Ⅰ酶切位点。RT-PCR扩增诺瓦克病毒核酸片段采用Takara公司的One Step RNA PCR Kit，反应总体积为25 μL，其中含有RNA模板2 μL，引物终浓度为500 nmol/L。反应参数为：42 ℃ 45 min，94 ℃2 min，然后94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，3个循环后改为94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.2.3 含有诺瓦克病毒核酸片段克隆的构建 常规法回收RT-PCR产物后，采用EcoR Ⅰ和Xoh Ⅰ双酶切，同时将pET32c载体同时双酶切，然后用T4连接酶4 ℃过夜连接，将其转化到TOP10感受态细胞，37 ℃过夜。
1.2.4 含有诺瓦克病毒核酸片段重组克隆的鉴定选取平板克隆，碱裂解法提取重组质粒，用EcoR Ⅰ和Xoh Ⅰ双酶切鉴定，同时将质粒送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
2 结 果
2.1 诺瓦克病毒阳性片段的获得 通过RT-PCR获得长319 bp大小片段，与设计相符（图1）。序列测定与设计完全一致。
2.2 含有诺瓦克病毒核酸片段克隆的获得
通过对抽提的重组质粒双酶切，确认诺瓦克病毒核酸片段已克隆到pET32c载体（图2）。
3 讨 论
诺瓦克病毒属于人类杯状病毒，引起的成人病毒性腹泻主要通过粪-口途径传播。该病毒存在于海鲜食品中，尤其是牡蛎，食用携带该病毒的海鲜食品，就可能被感染而发病，生吃贝类食物是沿海地区导致诺瓦克样病毒胃肠炎暴发流行的最常见原因。由于病毒在贝类生物的消化道内只是寄存，而不是像在人体内一样可以大量繁殖，因此在这些生物内的病毒量往往很低，远远低于病人粪便中的病毒量。而病人由于排毒时间不长，采样不多，所以诺瓦克病毒检测的阳性对照比较少，并且由于不能体外培养，无法确定病毒滴度。目前，诺瓦克病毒的检测方法有ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR等，但由于诺瓦克病毒现在仍然无法体外培养，因此，目前上述检测方法的阳性对照主要采用来自病毒感染者的带毒标本。类似这种阳性对照存在着多种缺点［3］。为了提高检测方法的准确性，特别是实时荧光RT-PCR的敏感性和特异性，建立标准的定量的阳性对照是必需的。
诺瓦克病毒基因组由7 642个核苷酸组成，包括3个主要开放读码框架（ORF），其中，ORF1中编码RNA多聚酶的区域序列与小RNA病毒的2C、3C和3D区序列相似，编码1 738个氨基酸的非结构蛋白前体；ORF2编码530个氨基酸的衣壳蛋白，该蛋白可以在体外自行组装成空壳状病毒颗粒，其外形和大小与天然病毒相似，具有抗原性。ORF3可能编码一个功能未知的小肽〖4,5〗。ORF1-ORF2的序列比较保守，编码病毒多聚酶，设计针对此序列的引物，可以快速检测诺瓦克病毒核酸。本研究成功地将诺瓦克病毒ORF1-ORF2的序列核酸片段克隆到载体上，使诺瓦克病毒核酸能够在实验室稳定表达，构建的质粒既可以作为核酸检测的阳性对照，也可进一步将其蛋白表达，用于ELISA检测。
【参考文献】
［１］GGREENBERG H B, VALDESUSO J, YOLKEN R H, et al. Role of Norwalk virus in outbreaks of nonbacterial gastroenteritis［J］. J Infect Dis, 1979,139:564-568.
［2］LI XIAO L I, PANG J K, BONTIA LEE, et al. Multiplex real time RT-PCR for the detection and quantitation of norovirus genogroups Ⅰ and Ⅱ in patients with acute gastroenteritis［J］. Journal of Clinical Virology, 2005,33:168-171.
［3］苏冬梅,刘玉兰,艾福花,等. 免疫斑点法对病毒性腹泻病人腺病毒抗体的检测［J］. 青岛大学医学院学报, 2003,38(1):54-55.
［4］FANKHAUSER R L, NOEL J S, MONROE S S, et al. Molecular epidemiology of “Norwalk-like viruses” in outbreaks of gastroenteritis in the United States［J］. J Infect Dis, 1998,178:1571-1578.
［5］DE WIT, KOOPMANS M P, VAN DUYNHOVENN. Risk factors for norovirus, sapporo-like virus, and group a rotavi-rus gastroenteritis ［J］. Emerg Infect Dis, 2003,9(12):1563-1570.
作者单位：莱西市市立医院检验科，山东 莱西 266600