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【摘要】 目的 通过对良、恶性周围神经肿瘤DNA倍体分析，佐以检测 p53基因表达，研究其与生物学行为之间的关系及临床鉴别诊断的意义。方法 采用流式细胞术对65例良、恶性周围神经肿瘤石蜡包埋组织进行肿瘤单细胞DNA倍体分析；同时，采用免疫组化技术对P53蛋白表达进行检测。结果 23例良性肿瘤DNA倍体检测均为二倍体；42例恶性周围神经鞘瘤（MPNST）中检出异倍体4例，二者差别无意义。SPF、PI值在良、恶性周围神经肿瘤中差别有显著意义（χ2=28.674、23.730,P<0.001），且与MPNST病理组织学分级呈正相关（rs=0.418、0.347,P<0.01、0.05）。 P53阳性表达在MPNST显著高于良性者（χ2=34.719,P<0.001）；P53阳性表达强度与MPNST恶性程度呈正相关（rs=0.326,P<0.05）。P53阳性表达强度与异倍体的出现及SPF、PI值均呈正相关(rs=0.318～0.354,P<0.05)。结论 SPF、PI值在良性周围神经肿瘤向恶性转化过程中会不断升高，对良、恶性周围神经肿瘤的鉴别诊断有临床应用价值。检测P53表达是鉴别诊断良、恶性以及判断MPNST恶性程度高低的一种有价值的方法。
【关键词】 周围神经系统肿瘤 DNA倍体分析 流式细胞术 基因 p53
周围神经来源的良、恶性肿瘤是临床常见肿瘤，以组织细胞学形态为主要根据判断其良、恶性有时相当困难，特别是生长活跃的神经纤维瘤与高分化的恶性周围神经鞘瘤（MPNST)的鉴别诊断。本研究采用流式细胞术对良、恶性周围神经肿瘤进行DNA倍体检测分析，同时佐以免疫组化法检测P53表达，以探讨其与组织细胞学形态的关系和对临床鉴别诊断的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
收集1996～2003年间青岛大学医学院附属医院病理科确诊为MPNST的石蜡包埋组织标本42例（高分化13例，中分化14例，低分化15例）；良性周围神经来源肿瘤的石蜡包埋组织标本23例（神经纤维瘤18例，神经鞘瘤4例，神经纤维瘤病1例）。所有病例均经组织病理学确诊。
1.2 流式细胞术
1.2.1 石蜡包埋组织的单细胞悬液的制备 50 μm厚的石蜡包埋组织连续切片5张，经二甲苯脱蜡48 h；体积分数1.00、0.95、0.70、0.50的梯度乙醇水化；加入3 mL胶原酶消化液，置37 ℃恒温水浴中作用消化30 min；尼龙网过滤，收集细胞悬液，1 500 r/min离心沉淀；PBS液漂洗，1 000 r/min离心沉淀。全部病例均制备细胞悬液涂片,保证镜下观察保留完整的细胞核；再行核酸染料标记DNA（DNA倍体分析试剂，BECKMAN COULTER公司）；30 min后上流式细胞仪进行检测分析，获得细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。
1.2.2 DNA倍体分析 采用细胞周期和DNA分析软件(MultiCycle AV for Windows advanced DNA Cell Cycle Analysis Software)进行各项指标的分析。DNA指数（DI）在 1.0±2CV之间（0.90～1.10）为二倍体，不在1.0±2CV之间为异倍体；增殖指数（PI）=〖（S+G2M）÷（G0/G1+S+G2M）〗×100%；S期细胞比率（SPF）=〖S÷（G0/G1+S+G2M）〗×100%。
1.3 免疫组化检测
一抗为鼠抗人P53单克隆抗体（购自SANTA CRUZ公司），工作浓度为1∶100，实验参照说明书的方法步骤进行操作，以乳癌P53阳性病例作为阳性对照。阳性判断标准：P53阳性信号呈棕黄色颗粒状，位于细胞核；阳性细胞数<1%为-,1%～24%为+，25%～50%为，>50%为。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件进行χ2检验、精确概率法检验以及Spearman等级相关检验。
2 结 果
2.1 临床病理特征
本组42例MPNST,肿瘤直径1.5～20.0 cm，肿瘤主体普遍较大，平均体积14.8 cm×7.7 cm×5.8 cm；而23例良性者,直径0.8～9.0 cm，瘤体平均体积3.5 cm×2.5 cm×1.6 cm。良、恶性肿瘤瘤体大小差异有显著性（χ2=12.002,P<0.001）。65例周围神经肿瘤大小、好发部位见表1。在组织学上存在良性肿瘤向恶性过渡者6例(14.2%)，同一肿瘤不同区域分化高低明显不同者9例(21.4%)，呈上皮样分化,以腺样结构形成为主要形态者2例(4.7%)。
2.2 DNA倍体分析
23例良性肿瘤DI值均在0.90～1.10之间，均判为二倍体；其SPF值均<15%，PI值均<20%。42例MPNST中检出异倍体4例（9.3%），该4例SPF值均>15%,PI值均>20%；另38例则为二倍体，但其SPF及PI值较良性肿瘤显著增高,其中29例(69.0%)SPF值≥15%,26例(61.9%)PI值≥20%。DNA倍体在良、恶性周围神经肿瘤中差异无显著性（χ2=0.976，P>0.05）。SPF、PI值在良、恶性周围神经肿瘤中差别有显著意义（χ2=28.674、23.730，P<0.001），且与MPNST病理组织学分级呈正相关（rs=0.418、0.347,P<0.01、0.05）。DNA倍体及SPF、PI值与42例MPNST其他临床病理指标间的关系见表2。表1 65例周围神经肿瘤大小、好发部位表2 DNA倍体及SPF、PI值与MPNST其他临床病理指标间的关系
2.3 P53的表达
23例良性周围神经肿瘤病人仅4例 (17.4%)P53呈阳性表达,而42例MPNST病人P53阳性者41例（97.7%）,二者差异有显著性(χ2=34.719,P<0.001)。42例MPNST的P53阳性表达强度与分化程度无关（χ2=2.454，P>0.05）。见表3。MPNST病人P53阳性表达与病人性别、肿瘤大小及好发部位均无关（χ2=0.321～3.454，P>0.05）。见表4。
2.4 DNA倍体分析各指标与P53表达的关系
本文42例MPNST中P53阳性表达强度与异倍体的出现及SPF、PI值均呈正相关(rs=0.318～0.354,P<0.05)。 见表5。表3 65例周围神经肿瘤P53的表达表4 P53与MPNST其他临床病理指标间的关系表5 MPNST病人 DNA倍体、SPF值、PI值与P53表达的关系
3 讨 论
3.1 临床病理特征
MPNST是周围神经来源的恶性肿瘤,亦曾称恶性雪旺细胞瘤或神经纤维肉瘤［1］。研究表明，它是由EMA阳性的神经束膜细胞、雪旺细胞、纤维母细胞、CD34阳性的树突状细胞、原始神经上皮细胞等构成的一种异质性的肿瘤［2］。因此,MPNST可以出现不同的组织学形态特征。
本组有2例MPNST完全呈上皮样分化,并以腺样结构形成为基本的组织学形态,很容易误诊为腺癌。结合其发病部位、多部位取材和免疫组化的支持,将有助于做出正确诊断。本组资料有相当比例的MPNST在组织学上有良性向恶性过渡的形态学表现;同一肿瘤也有分化明显不同的区域。因此,应对肿瘤多点取材,特别是冷冻切片, 有助于临床避免误诊或分级不当的情况发生。
本组42例MPNST的发病部位与GHOSH等［１］报道的分布基本相符，以肢体、头颈部和腹膜后多见，其中四肢最多见。本组42例MPNST肿瘤的大小不等，但平均体积明显大于良性者。因此，临床观察肿瘤的大小对良、恶性的识别有一定意义［3］。
3.2 DNA含量分析
目前认为, 采用流式细胞术定量分析肿瘤细胞DNA含量，是一种较客观的判断恶性度的指标［4］。本研究良、恶性周围神经肿瘤中异倍体的检出率差异无统计学意义，提示MPNST可能是以二倍体为主的恶性肿瘤, DNA倍体含量分析对其良恶性鉴别诊断的意义尚需进一步观察。
但是本研究结果表明,流式细胞术DNA含量分析中的SPF、PI值是反映周围神经肿瘤增殖活性的重要指标。本文MPNST的SPF、PI值明显高于良性周围神经肿瘤，且其SPF、PI值与该恶性肿瘤病理分级呈正相关，即SPF、PI值在良性周围神经肿瘤向恶性肿瘤转化以及在MPNST分化程度降低过程中都会不断升高。由此得出结论，DNA倍体分析中SPF、PI值对良、恶性周围神经肿瘤的鉴别诊断有临床应用价值；同时, SPF、PI值升高也是MPNST演进和恶性程度升高的表现。因此，异倍体的出现以及SPF、PI值的增高是反映MPNST生物学行为恶化的重要标志,可以作为检测该恶性肿瘤演进侵袭及判断预后的较为客观的指标。
本实验观察到MPNST DNA直方图中G0/G1的CV值为5.2%～18.1%(平均10.33%)，明显高于新鲜标本（5.0%），并且也明显高于其他以软组织成分为主的肿瘤，如滑膜肉瘤（7.8%）及恶性淋巴瘤（8.2%）［5］。本研究还显示，在MPNST G1主峰前出现另外一个细胞峰，为区分其为凋亡还是细胞碎片所致，或者是异倍体，在加PI染液前用DNA酶消化此单细胞悬液，每次加DNA酶消化液3 mL，消化3 min，结果显示G1主峰前的细胞峰消失，证明其为细胞碎片。由此可见，由于MPNST细胞核较大，切片时会造成细胞碎片较多以及因实验条件的限制，实验中可能造成肿瘤细胞碎片较多，故而CV值增大，分辨率降低，这可能掩盖了部分接近二倍体的异倍体，所以MPNST中异倍体的实际发生率可能还要更高。
3.3 p53基因表达
p53基因是目前研究最多的抑癌基因，大约50%～60%的恶性肿瘤与p53基因突变有关。本文结果显示，良、恶性周围神经肿瘤中p53的阳性表达差异有显著性。因此推测p53作为一抑癌基因，基因突变导致其功能丧失，可能在良性周围神经肿瘤恶变演进的过程中起了非常重要的作用，与WATANABE等［6］研究的p53在良、恶性周围神经肿瘤中的表达情况得出的结论一致。MENON等［6］在研究中发现，由良性的Ⅰ型神经纤维瘤病恶性转化形成的神经纤维肉瘤17号染色体多态性DNA标记均丢失。而且共同缺失区并不是Ⅰ型纤维瘤病的致病基因NF1所在的17p，而是17p12-17p13。此处正是p53基因的点位，在良性神经纤维瘤病的瘤细胞中并无此类缺失,说明细胞的恶变与p53基因的丢失有关。结合本研究结果，p53免疫组化检测可以作为良、恶性周围神经肿瘤鉴别诊断的一个有价值的指标。
随着MPNST分化程度的降低，p53阳性表达强度增强，我们认为p53的突变使该恶性肿瘤在演进过程中分化程度越来越低，越来越具有侵袭性，这正是该恶性肿瘤异质化的一种表现，因此，p53亦可以作为MPNST恶性程度及预后判断的一个有价值的指标。
3.4 SPF、PI值和异倍体与P53表达的关系
本实验结果表明,MPNST中P53阳性表达与PI值有关（P<0.05）,而P53阳性表达强度与SPF、PI值和异倍体的检出率呈正相关（P <0.05）,即随着P53阳性表达强度的增加SPF、PI值升高，异倍体发生概率增加。
上述结果表明,P53检测与DNA倍体分析的SPF、PI值和异倍体检出率有着密切的关系。同时进行检测,无论是对良、恶性周围神经肿瘤的鉴别诊断还是对MPNST恶性程度的判断均有实际的临床意义,有助于临床的鉴别诊断和恰当病理组织学分级，有利于临床治疗和预后的监测。
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作者单位：潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041