原发性肝癌组织中螺杆菌相关基因的检测

【摘要】  目的 探讨原发性肝细胞癌（HCC）与螺杆菌感染关系。方法 选取经病理诊断的38例HCC病人的癌组织作为实验组，28例非肝癌肝病组织、29例胃癌组织、18例结肠癌组织和18例子宫肌瘤组织作对照组。采用聚合酶链反应（PCR）扩增螺杆菌属16S rRNA基因，扩增产物经Southern杂交确认，并进行测序及同源性比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌的特异基因26kDa 及相关基因cagA、vacA、rps4、glmM以进一步验证是否为幽门螺杆菌感染。结果 38例HCC标本中有27例检出螺杆菌属16S rRNA基因，阳性率为71.1%；29例胃癌标本有23例检出螺杆菌属16S rRNA，阳性率为79.3%，两组比较差异无显著性（P>0.05）；与其他对照组（均未扩增出16S rRNA基因）比较差异有显著性（χ2=24.70～33.67，P<0.01）。16S rRNA PCR 产物经Southern杂交证实为幽门螺杆菌。序列测定表明，HCC和胃癌组织中的螺杆菌16S rRNA序列与幽门螺杆菌序列有97.8%的同源性。Hp特异相关基因检测结果，26kDa基因扩增阳性率82.0%；cagA基因扩增阳性率18.3%；glmM基因扩增阳性率15.0%；均未扩增出vacA和 rps4基因。结论 HCC病人肝组织中存在螺杆菌感染且感染率较高，螺杆菌感染与HCC可能存在相关性。

【关键词】  癌，肝细胞；螺杆菌属；基因；聚合酶链反应

DETECTION OF HELICOBACTER SPECIES RELATED GENES IN LIVER TISSUE OF PRIMARY LIVER CANCER  SUN DONGMING, CUI QUN, QIANG XIN (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the relationship between helicobacter infection and hepato cellular carcinoma(HCC).  Methods This study consisted of 33 HCC patients confirmed pathologically, 28 samples from patients with nonHCCliverdisease tissue, 29 cases with gastric cancer, and 18 with colon cancer. Eighteen cases with uterus myoma served as controls. Helicobacter species in liver specimens from the studied subjects were examined by polymerase chain reaction (PCR) with Helicobacter specifie 16S rRNA primers. Besides, amplified products were identified by Southern hybridization and sequenced further. The idiogene 26kDa and related genes cagA, vacA, rps4 and glmM of positive findings were also detected by PCR to authenticate whether it was HP. Results Twentyseven of the 38 samples of HCC were positive for Helicobacter 16S rRNA gene, while in 29 gastric cancer samples, 23 were positive. The difference between the two groups was not significant (P>0.05), compared with the other control groups, the difference was significant (χ2=24.70-33.67,P<0.01). The PCR amplified products were identifiled by Southern hybridization. The sequencing showed 97.8% homology of Helicobacter 16S rRNA in tissue of liver and gastric cancer.  Conclusion A higher Helicobacter infection rate exists in HCC tissue, which likely correlates with HCC. The liver tissues of HCC patiens with a high infection rate, suggesting an association between Helicobacter infection and HCC.

    ［KEY WORDS］ Carcinoma, hepatocellular; Helicobacter; Genes; Polymerase chain reaction

    自1982年澳大利亚学者WARREN和MARSHALL首先从人胃黏膜组织中培养出幽门螺杆菌（Hp），并确定其与胃、十二指肠疾病的发病相关以来，报道Hp与心血管疾病、呼吸系统疾病、肝胆疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、皮肤及口腔疾病、糖尿病等各种疾病相关性的文献越来越多，对Hp的研究更加广泛深入[1～6]。其中Hp与肝癌的相关性研究是近年的研究热点之一。本实验通过对临床肝癌组织标本螺杆菌相关基因检测的情况，来探讨螺杆菌感染与原发性肝细胞癌(HCC)的关系，为进一步研究螺杆菌在肝癌发生中的作用机制奠定基础。现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2等PCR反应试剂购自上海生工生物工程服务有限公司；CSPD、 DNA Marker Ⅷ、地高辛标记检测试剂盒（Cat.No.1362372）购于德国罗氏公司；Southern杂交用胶片购自柯达公司（XOMAT CAT1651454）；其余试剂均为国产AR级。PCR阳性对照为H. pylori国际标准株NCTC11637（山东医科大学基础学院惠赠），阴性对照为无菌双蒸水和大肠菌、链球菌DNA。

    1.2  方法

    1.2.1  标本的收集和分组  以青岛市市立医院与青岛大学医学院附属医院肝胆外科、普外科、妇科2005年3月～2007年3月收治的38例HCC病人的癌组织作为实验组，男32例，女6例，年龄28～71岁，平均52岁。另选其他肝病肝组织、胃癌组织、结直肠癌组织、子宫肌瘤组织为对照组，其中其他肝病组28例（肝外伤破裂手术修补7例，肝脏血管瘤9例，巨大肝囊肿6例，肝内胆管结石6例），男22例，女6例，年龄34～68岁，平均为48岁；胃癌组29例，男23例，女6例，年龄48～77岁，平均61岁；结直肠癌组18例，男10例，女8例，年龄26～74岁，平均55岁；子宫肌瘤组18例，年龄43～53岁，平均49岁。诊断均经病理检查证实。

    1.2.2  组织 DNA的提取  各组标本分别用匀浆器制成匀浆， 加适量2.5 g/L胰蛋白酶和200 mg/L胶原酶处理后加入裂解液(含蛋白酶K)，充分混匀，37 ℃水浴过夜后，采用氯仿异戊醇法抽提获得，4 ℃保存备用。细菌DNA抽提采用溶菌酶、蛋白酶K及酚氯仿法提取。

    1.2.3  PCR扩增  利用DNAStar软件包从基因文库中下载已知螺杆菌（包括H.pylori等20余种）和大肠埃希菌、溶血链球菌和嗜肺巴氏菌等16S rRNA基因序列，通过比较以上各菌种基因的高保守区序列，优化并设计出一对特定的螺杆菌共用引物。Hp的特异基因26kDa 及其相关基因cagA、vacA、rps4、glmM引物序列见文献[2]。PCR反应总体积50 μL，内含无酶水20.5 μL，10×buffer5 μL，Mg2+ 3.5 mmol/L,dNTP各0.2 mmol/L，TagDNA聚合酶2.5 U，2个引物各1 μmol/L，模板5 μL,各PCR引物序列、反应条件与扩增片段大小见表1。

    1.2.4  Southern杂交  为确认螺杆菌属16S rRNA基因的特异性，我们使用DNAStar软件包优化并设计出一条长36 bp的Helicobacter pp.属特异cDNA探针和3条长均为15 bp的种特异探针，分别为H.pylori、H.hepaticus和H. fennellia。探针由北京奥科生物有限公司合成。标记探针操作按Digoligonucleotide 3′末端标记试剂盒说明书进行，加抗地高辛抗体（1∶5 000）作用后，再加CSPD工作液，曝光显影后观察。

    1.2.5  DNA序列分析  经Southern 杂交确认的HCC和胃癌组织的16S rRNA产物应用JETsorb DNA纯化试剂盒进行PCR产物纯化，将纯化后的DNA产物送大连宝生物公司进行DNA序列测定，并与部分螺杆菌和其他细菌16S rRNA基因序列进行同源比较。

    1.3  统计学处理

    采用四格表χ2检验法对结果进行统计学处理。表1  PCR引物序列、反应条件及扩增的目的片段大小基因引物序列PCR反应条件目的片段

    2  结    果

    2.1  PCR扩增

    38例HCC标本中有27例检出螺杆菌属16S rRNA基因， 阳性率为71.1%；29例胃癌标本有23例检出螺杆菌16S rRNA基因，阳性率为79.3%。其他组未扩增出16S rRNA基因。HCC和胃癌组间阳性率差异无显著性（χ2=0.494，P＞0.05），而与其他对照组相比较差异均有统计学意义（χ2=24.70～33.67，P＜0.01）。在所有50例螺杆菌属16S rRNA基因阳性标本中，有41例扩增出26kDa基因（其中HCC组23例，胃癌组18例），扩增阳性率为82.0%；而仅11例扩增出cagA基因，扩增阳性率为18.3%；9例扩增出glmM基因，扩增阳性率为15.0%；均未扩增出vacA和 rps4基因。见表2、图1。

    2.2  Southern杂交

    16S rRNA基因PCR扩增阳性的标本，经电转移后，以特异探针杂交，胶片显影定影后观察，确认PCR扩增产物的特异性。结果显示对Helicobacter pp.属特异探针和H.pylori种特异探针均为阳性结果（图2）。表2  各组螺杆菌属扩增16S rRNA、26kDa及cagA、vacA、rps4及glmM基因阳性结果比较

    2.3  DNA序列测定及对比

    螺杆菌16S rRNA基因PCR扩增阳性标本经纯化后，均进行DNA序列测定，测序结果经与多种螺杆菌16S rRNA基因序列对比，发现与H.pylori 16S rRNA基因序列同源性平均达97.8%以上。

    3  讨    论

    Hp在消化系统疾病中的致病作用越来越受到人们的重视，近年来美国学者WARD等[7]于1994年从小鼠分离培养了一种新的螺杆菌，它可以引起小鼠肝癌的发病率上升，且与H.pylori具有高度同源性，命名为肝螺杆菌（H.hepaticus，Hh），表明螺杆菌可能与HCC的发病有关。DE MAGALHAES QUEIROZ等[8]从一名女性肝硬化病人肝组织中成功培养出一株螺杆菌，经DNA序列分析该螺杆菌与Hp同源性高达99.38%。尤其是螺杆菌感染小鼠诱发HCC动物模型的建立[9]，使Hp与HCC的相关性研究进一步加快，成为研究热点。国内相关研究起步较晚，缺乏系统资料，为进一步系统验证Hp与HCC之间的相关性，我们在前期进行的细菌分离和电镜检查基础上，对几年来收集的癌组织标本进行了螺杆菌相关基因的PCR扩增。在71.7%的肝癌组织和79.3%的胃癌组织中发现螺杆菌属16S rRNA, 同时应用特异性探针进行Southern杂交得到确认。统计学处理显示两者之间无明显差异（P>0.05），而与其他对照组比较差异均有显著性（P<0.01），表明与胃癌一样，HCC病人癌组织中存在螺杆菌感染情况，并且感染率很高。经测序证实与H.pylori有97.8%的同源性。

    Hp特异性基因26kDa是Hp种特异性表面抗原，存在于所有Hp中[10]。相关功能基因cagA+为细胞毒素相关基因，使Hp具有细胞毒作用，并可直接导致机体局部和整体免疫力低下；而vacA为空泡毒素基因，存在于所有Hp菌株中，但仅有60%的菌株表达vacA；glmM基因编码尿素酶C，也存在于所有Hp中；rps4基因编码核糖体蛋白S4，在Hp中具有高度保守性。本文的结果显示，在所有50例16S rRNA基因阳性组织样本中，26kDa、cagA、glmM 的检出率分别为82.0%、18.3%和15.0%，均未扩增出vacA和 rps4基因,与国内有关资料基本一致[2]。这一结果也表明，在肝癌组织中确实有相当一部分感染或感染过Hp，从而提示螺杆菌感染与HCC的发生可能有一定的相关性，尚需进一步开展其致病机制研究。尽管从测序结果显示与Hp具有高度同源性，但在基因表达上却有着明显不同，其产生的确切原因还有待于进一步研究。

【参考文献】
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[7]WARD J M, FOX J G, ANVER M R, et al. Chronic active hepatitis and associated liver tumors in mice caused by a persistent bacterial infection with a novel Helicobacter species[J]. J Natl Cancer Inst, 1994,16:12221227.

[8]DE MAGALHAES QUEIROZ D M, SANTO A. Isolation of a Helicobacter strain from the human liver[J]. Gastroenterology, 2001,121:10231024.

[9]AVENAUD P, LE BAIL B, MAYO K, et al. Natural history of Helicobacter hepaticus infection in conventional A/J mice, with special reference to liver involvement[J]. Infect Immun, 2003,6:36673672.

[10]AVENAUD P, MARAIS A, MONTEIRO L, et al. Detection of helicobacter species in the liver of patients with and without primary liver carcinoma[J]. Cancer, 2000,89:1431.

作者单位：青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021