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【摘要】 目的 观察不同剂量健龄宝方剂对环磷酰胺所致免疫力低下小鼠免疫功能的影响。方法 将小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组及低、中、高剂量健龄宝组，每组10只。应用环磷酰胺制备免疫力低下动物模型。通过行碳粒廓清试验，分析脾、胸腺质量，MTT法测定脾淋巴细胞转化率，检测血清溶血素含量，流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群等各项免疫指标。结果 模型组小鼠的各项指标均显著降低，健龄宝方剂能够提高免疫抑制小鼠的碳粒廓清指数，使脾淋巴细胞转化率升高，提高血清溶血素含量，使CD+4/CD+8比值升高(F=3.46～9.23，q=4.77～7.63，P<0.05、0.01)。结论 健龄宝可增强环磷酰胺所致免疫力低下小鼠的非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫功能，并能纠正T淋巴细胞亚群的紊乱。
【关键词】 健龄宝;环磷酰胺;淋巴细胞活化;T淋巴细胞亚群;溶血素类;小鼠
EFFECTS OF JIANLINGBAO ON IMMUNE FUNCTION IN MICE WITH HYPOIMMUNITY ZHAO ZHENHUAN, JING WEILI, SUN XIANGHONG, et al (Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); Objective To observe the effects of different doses of Traditional Chinese Compound Prescription, Jianlingbao, on immunosuppressed mice cause by cyclophosphamide. Methods The mice were randomly divided into six groups (10 in each group): blank control group, model group, positive control group and Jianlingbao groups (low, medium and high dosage). An immunosuppressed mouse model was induced by cyclophosphamide administration. Carbon clearance test was performed. The immune organ weight was recorded. Splenic lymphocyte transformation rate was determined by MTT method. The serum level of hemolysin was determined. T cell subsets were analyzed with flow cytometer. Results All the indices in the model group were reduced. Jianlingbao administration increased the carbon clearance rate, the splenic lymphocyte transformation rate, the serumlevel of hemolysin and the CD+4/CD+8 radio of the model mice (F=3.46-9.23;q=4.77-7.63;P<0.05,0.01). ConclusionJianlingbao can improve the nonspecific, humoral and cellular immune functions of cyclophosphamideinduced immunosuppressed mice, and rectify T cell subset disproportion.
[KEY WORDS] Jianlingbao; Cyclophosphamide; Lymphocyte activation; Tlymphocyte subsets; Hemolysins; Mice
健龄宝是经验处方，其主要成分有首乌、黄芪、灵芝、当归等，具有补肝益肾、健脑安神的作用，用于治疗肝肾精血亏虚、头晕、须发早白等症疗效显著。本文观察了该药对环磷酰胺所致免疫力低下小鼠免疫功能的影响，并探讨该方药的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品与试剂 注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号06021821)，贞芪扶正颗粒(上海静安制药有限公司生产，批号0601161)，健龄宝口服液(青岛大学医学院附属医院制剂室配制)。一得阁墨汁，无菌Hanks液，4 g/L锥虫蓝溶液，RPMI 1640制成完全培养液，ConA溶液(美国Sigma 公司)，5 g/L的MTT溶液，酸性异丙醇溶液，PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，Alsever溶液，绵羊红细胞(SRBC)悬液，豚鼠血清，都氏试剂，PEcy5 antimouse CD3单克隆抗体、PE antimouse CD4 单克隆抗体、APC antimouse CD8 单克隆抗体(Gene Tech公司产品)，溶血素(BD公司产品)。
1.1.2 动物 昆明种小白鼠60只，体质量为18～22 g，雌雄各半，由青岛市药检所动物中心提供(动物生产许可证号:SCXK0013)。
1.1.3 主要仪器 722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司生产)，流式细胞仪(BD FACSCcalibur TM)，超净工作台，普通显微镜，血细胞计数板，离心机(美国Beckman公司)，96孔培养板，酶联免疫检测仪(奥地利TECAN公司)，CO2孵箱(德国Heraeus公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及处理方法 将小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组及低、中、高剂量健龄宝组，共6组，每组10只。各组小鼠每天灌胃一次，每次0.02 mL/g体质量，连续灌胃14 d，空白对照组和模型组灌胃注射用水，阳性对照组灌胃贞芪扶正溶液(根据小鼠与人的体表面积换算关系配制药液)，各剂量健龄宝组灌胃不同剂量的健龄宝(按照每千克4、8、16 g生药的给药剂量配制同容量不同浓度的药液)。于灌胃的第10天开始，模型组、阳性对照组及低、中、高剂量健龄宝组于灌胃的同时腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg[1]，空白对照组注射生理盐水，连续4 d。
1.2.2 免疫器官质量测量与碳粒廓清试验 第14天，灌胃2 h后，尾静脉注射1∶4稀释的墨汁，分别于尾静脉注射后2和10 min，用定量毛细管于球后毛细血管丛取血20 μL，溶于1 g/L的Na2CO3溶液3 mL中。用毛细管吹打均匀，置722型分光光度计于波长680 nm处比色，测定吸光度(A)值。然后将小鼠颈椎脱臼处死，分别取肝、脾、胸腺，称质量并计算脏器指数和校正廓清指数α。
1.2.3 淋巴细胞转化试验 第14天，灌胃2 h后，将小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出脾脏，制成脾细胞悬液。用锥虫蓝染色计数活细胞数应在95%以上。调整细胞密度为2×109/L。将细胞悬液分两孔加入96孔培养板中，每孔1 mL，一孔加浓度100 mg/L ConA 50 μL，另一孔不加ConA作为对照，每份分装3孔作为平行样，置体积分数0.05 CO2、37 ℃条件培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时每孔加入5 g/L MTT50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定A值。
1.2.4 血清溶血素测定 于灌胃第9天腹腔注射体积分数0.05 绵羊红细胞，每只0.2 mL，免疫6 d后摘除小鼠眼球取血，放置1 h，2 000 r/min离心10 min，分离血清，血清用生理盐水作1∶2稀释。实验管中依次加入稀释的血清样品250 μL,体积分数0.10 SRBC 125 μL和补体250 μL;对照1管依次加入体积分数0.10 SRBC 125 μL、补体250 μL和生理盐水250 μL;对照2管依次加入体积分数0.10 SRBC 125 μL、生理盐水250 μL和稀释后的血清样品250 μL。37 ℃孵育30 min后，冰上终止反应10 min，以2 000 r/min离心10 min。取上清液250 μL加入到96孔培养板中，以酶标仪测定波长540 nm处的A值。
1.2.5 T细胞亚群的测定 摘除小鼠眼球取血，肝素抗凝，立即取20 μL抗凝全血与2 μL CD3(PECy5)单抗、2 μL CD4(PE)单抗和2 μL CD8(APC)单抗混合,室温下遮光孵育30 min,用200 μL溶血素裂解红细胞10 min,1 500 r/min离心 5 min获取有核细胞，用PBS洗绦2次,弃上清液,用10 g/L多聚甲醛200 μL固定后上流式细胞仪分析。设各种单克隆抗体单标管各1支,空白对照管1支。
1.3 统计学处理
数据采用SPSS 11.0及PPMS 1.5[2]软件处理，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 免疫器官质量与碳粒廓清试验
模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数、廓清指数α均显著降低，与空白对照组比较差异有显著性(F=3.46～9.08，q=4.93～7.50，P<0.01)。健龄宝对胸腺质量和脾脏质量的影响不明显。健龄宝可使校正廓清指数α显著提高且呈剂量依赖性，与模型组比较，低剂量时有所提高但差异不明显(P>0.05)，中、高剂量时廓清指数有显著提高(q=4.97、6.94，P<0.05、0.01)。见表1。
2.2 淋巴细胞转化试验
模型组脾淋巴细胞增殖能力与空白对照组比较显著下降(F=5.53，q=5.94，P<0.01)。健龄宝对小鼠脾淋巴细胞的增殖有显著性影响(q=4.96～5.87，P<0.05、0.01)。见表2。
2.3 血清溶血素测定
模型组血清溶血素水平与空白对照组比较显著性降低(F=8.00，q=6.74，P<0.01)。中、高剂量健龄宝组血清溶血素水平与模型组比较均有显著提高(q=4.77、6.28，P<0.05、0.01)。见表2。
2.4 T细胞亚群的测定
环磷酰胺使小鼠CD+4T细胞百分比下降，CD+8 T细胞百分比上升,CD+4/CD+8的比值下降,而健龄宝中、高剂量组能不同程度对抗环磷酰胺的这种作用(F=7.73～9.23，q=4.93～7.63，P<0.05、0.01)。见表3。
3 讨 论
胸腺、脾脏为机体的重要淋巴器官。胸腺是T淋巴细胞分化成熟的场地，其结构及功能与机体状态紧密相关。胸腺指数的降低以及胸腺萎缩，都是小鼠以细胞免疫为主的免疫抑制的表现。碳粒廓清法、溶血素抗体测定法、小鼠淋巴细胞增殖反应法，表1 健龄宝对小鼠免疫器官质量及廓清指数α的影响表2 健龄宝对小鼠脾淋巴细胞转化及血清溶血素水平的影响表3 健龄宝对T淋巴细胞亚群的影响
分别是观察机体非特异性免疫功能和特异性体液免疫、细胞免疫功能常用的药理实验方法[3]。
T淋巴细胞可以分为CD+3、CD+4和CD+8 T淋巴细胞，CD+3细胞水平反映总T淋巴细胞水平, CD+4和CD+8细胞是T淋巴细胞两大亚群，CD+4 T淋巴细胞在机体的免疫反应中处于非常重要的中心地位，它通过分泌多种淋巴因子激活其他T、B 细胞亚群及参与免疫反应的其他细胞，使其增殖和分化，并协调免疫细胞间的相互作用，发挥机体免疫系统的功能[4]。CD+4 /CD+8 的比值上升，提示免疫应答的正调节占优势，而比值下降，提示免疫功能低下。
本实验建立的环磷酰胺免疫小鼠模型与空白对照组比较，各项指标差异均具有显著性，说明模型建立成功。本实验结果表明，健龄宝在碳粒廓清试验中，可提高廓清指数，提高小鼠单核吞噬细胞的吞噬指数和吞噬活性，说明健龄宝对网状内皮系统吞噬功能具有明显的激活、增强作用。提示健龄宝对小鼠非特异性免疫功能具有增强作用。健龄宝可明显改善环磷酰胺所致的小鼠血清溶血素含量降低现象，促进小鼠溶血素抗体生成，对环磷酰胺所致免疫抑制有拮抗作用。可使小鼠脾淋巴细胞转化反应增强，提高淋巴细胞的转化率。说明健龄宝可提高小鼠特异性体液免疫和细胞免疫功能。本文通过对外周血中T淋巴细胞亚群的测定，表明健龄宝能够使CD+4T淋巴细胞的百分含量升高，使CD+4 /CD+8 的比值上升。提示健龄宝对T淋巴细胞免疫系统起正调节作用。
本文通过观察健龄宝对多项免疫指标的影响，证明健龄宝可提高环磷酰胺所致免疫力低下模型小鼠的非特异性免疫功能、体液免疫功能和细胞免疫功能，能够纠正T淋巴细胞亚群的紊乱，使免疫力低下小鼠CD+4/CD+8比值提高至接近正常水平，对免疫力低下小鼠有较好的免疫功能增强作用。
越来越多的研究表明，应用免疫调节药物能够增强免疫功能，延缓衰老的进程[5]。研究开发新的延缓衰老的制剂成为很有价值课题。中药单方或复方制剂大多具有双向调节免疫功能的作用，充分发掘祖国医学在这方面的潜力和优势，将是抗衰老研究的重要组成部分。
【参考文献】
[1]郭紫芬,何淑雅,朱炳阳,等. 环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2008,24(11):991101.
[2]周晓彬，纪新强，徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报， 2009,45(1):9193.
[3]熊筱娟,易增兴,徐丽英,等. 乌索酸对小鼠免疫功能影响的实验研究[J]. 免疫学杂志, 2008,24(1):116117.
[4]刘吉勇,卢芳国,朱惠斌,等. 应用环孢菌素A制备小鼠免疫缺陷动物模型[J]. 实用预防医学, 2008,15(5):13761378.
[5]李同霞,仇美健,纪海玲. 中药肺痨宁对复治肺结核病人的免疫调节作用[J]. 齐鲁医学杂志, 2006,2(1)：3536.
作者单位：(青岛大学医学院附属医院药剂科,山东 青岛 266003)