宫颈癌组织Raf激酶抑制蛋白和NFκB p65表达及其临床意义

【摘要】  　　目的 研究宫颈癌组织中Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和核因子κB p65 (NFκB p65)的表达，探讨二者表达之间的相关性及其与宫颈癌各临床病理因素之间的关系。方法 用免疫组织化学方法检测69例宫颈癌组织、37例宫颈上皮内瘤变组织和18例正常宫颈组织的RKIP和NFκB p65表达,并分析其与宫颈癌临床病理学特征的关系。结果 宫颈癌组织中RKIP的表达低于宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织,而NFκB p65的表达高于宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织,差异有统计学意义(Hc=45.124、38.107,Z=4.309～5.159，P<0.01); RKIP和NFκB p65在宫颈癌组织中的表达均与临床分期、有无淋巴结转移及肿瘤分化程度有关(χ2=5.150～11.917,P<0.05)。宫颈癌组织中RKIP与NFκB p65的表达呈显著负相关(r=-0.464,P<0.01)。结论 RKIP表达的减少或缺失与宫颈癌的发生、发展密切相关, RKIP表达的减少或缺失可能通过上调NFκB p65的表达促进宫颈癌的侵袭和转移。

【关键词】  宫颈肿瘤　Raf激酶抑制蛋白　核因子κB p65　肿瘤转移

　　EXPRESSIONS OF Raf KINASE INHIBITOR PROTEIN AND NFκB p65 IN CERVICAL CANCER AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE

　　WU JINGLI, JI XINQIANG, LI FAHONG

　　(Department of Gynecology and Obstetrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the expressions of Raf kinase inhibitor protein (RKIP) and nuclear factor kappa B p65 (NFκB p65) in cervical cancer and explore the correlation between them and their association with clinical pathologic factors of the disease.  Methods RKIP and NFκB p65 were detected immunohistochemically in tissues of 69 cases of cervical cancer,37 of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 18 of normal cervix, The relationship among RKIP,  NFκB p65 and cervical cancer were analyzed.  Results The expression of RKIP was lower in cervical cancer than that in CIN and normal cervix, while that of NFκB p65 in cervical cancer was higher than CIN and the normal one, the difference was significant (Hc=45.124,38.107;Z=4.309-5.159,P<0.01). The expressions of RKIP and NFκB p65 in the cancer were associated with clinical staging, with or without lymph node metastasis and cell differentiation of the cancer (χ2=5.150-11.917,P<0.05). RKIP expression was negatively correlated  with NFκB p65 (r=-0.464,P<0.01). Conclusion Low or loss of RKIP expression is closely related with the development and progression of cervical cancer, which facilitates the invasion and metastasis of the disease, probably, by upregulating NFκB p65 expression.
   
　　［KEY WORDS］ cervix neoplasms; raf kinase inhibitor protein; nuclear factorkappa b p65; neoplasm metastasis
   
　　Raf激酶抑制蛋白(RKIP) 是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族中的一员,其在大肠杆菌、植物酵母、线虫、果蝇、开花植物和哺乳动物的不同组织中均有表达[13]。YEUNG等[4]的研究结果显示，RKIP可以与Raf1结合，从而抑制Raf1／MEK／ERK信号通路。RKIP 还参与了对G蛋白偶联受体信号通路[5]和核因子κB p65 (NFκB p65)信号通路[6]的调控。研究还显示，RKIP具有抑制肿瘤细胞转移的作用[7]。因此，RKIP的研究已成为肿瘤细胞生物学领域中的一个新的研究热点。然而，RKIP在宫颈癌组织中的表达情况及其在宫颈癌发生发展中的作用国外报道较少,国内未见报道。本研究应用免疫组织化学法检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织中RKIP和NFκB p65的表达, 探讨RKIP与NFκB p65之间及其与宫颈癌侵袭、转移之间的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料
   
　　从青岛大学医学院附属医院2006—2008年收治的宫颈癌病例中选取临床病理资料完整的宫颈癌术后肿瘤组织石蜡标本69例。病理分级:高分化(Ⅰ级) 20例,中分化(Ⅱ级) 28例,低分化(Ⅲ级) 21例。临床分期(按国际妇产科联盟2000年的标准):Ⅰa期27例, Ⅰb期24例,Ⅱa期18例。病理类型:鳞癌57例,腺癌12例。另取同期本院存档的宫颈上皮内瘤变组织蜡块37例、因子宫肌瘤行子宫切除的正常宫颈组织蜡块18例作为对照。所有病例术前均未接受放、化疗及免疫治疗,病理诊断由病理科专家复诊。

　　1.2  RKIP和NFκB p65表达检测
   
　　应用免疫组织化学方法。兔抗人RKIP多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,工作浓度1∶100;鼠抗人NFκB单克隆即用型抗体及PV6000免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。按照PV6000二步法免疫组织化学染色试剂盒说明操作, DAB 显色。用已知阳性的切片作阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3  结果判断
   
　　RKIP阳性染色定位于细胞浆,部分可出现细胞膜着色；NFκB p65免疫组化阳性着色主要位于胞核或胞浆。RKIP和NFκB p65的蛋白表达采用双评分半定量法进行评分, RKIP在细胞浆及NFκB p65在细胞核和(或) 细胞浆有浅黄色、棕色、棕褐色颗粒沉着为阳性细胞,高倍镜下根据染色强度和阳性细胞所占比例进行结果判定。染色强度评分标准:不着色, 0分;黄色, 1分;棕黄色, 2分;棕褐色, 3分。阳性细胞所占比例的评定标准:阳性细胞率≤25%为 0分; 26%～50%为 1分; 51%～75% 为2分; > 75%为 3分。2项评分相加: 0～1 分为阴性(-); 2 分为弱阳性(+);3～4分为阳性(); 5～6分为强阳性()。

　　1.4  统计学分析
   
　　采用SPSS 11. 5及PPMS 1.5[8]统计学软件进行数据处理, KruskalWallis方法分析宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织之间RKIP和NFκB p65的表达差异,两两比较采用MannWhitney U检验，RKIP、NFκB p65在宫颈癌中的表达及其与临床病理因素的关系采用χ2检验、四格表精确检验法，宫颈癌组织中RKIP、NFκB p65蛋白表达的相关性用Spearman 等级相关分析,以P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  RKIP和NFκB p65在不同宫颈组织表达
   
　　RKIP在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织的阳性表达率分别为29.0%、75.7%和88.9%，RKIP在宫颈癌组织中的表达低于宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织，差异有显著意义（Hc=45.124，Z=5.159、5.012，P<0.01）。NFκB p65在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织的阳性表达率分别为69.6%、27.0%和11.1%。NFκB p65在宫颈癌组织中的表达高于宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织，差异有显著性（Hc=38.107,Z=4.442、4.309，P<0.01）。见表1。表1  RKIP和NFκB p65在不同宫颈组织表达（略）

　　2.2  RKIP、NFκB p65 在宫颈癌组织表达及其与临床病理因素的关系
   
　　RKIP在中、高分化组宫颈癌中的阳性表达率显著高于低分化组（χ2=6.492,P<0.05），在Ⅱa、Ⅰb期的阳性表达率则显著低于Ⅰa期宫颈癌组织（χ2=5.150,P<0.05），有盆腔淋巴结转移组显著低于无淋巴结转移组（χ2=5.555，P<0.05）。NFκB p65在中、高分化组宫颈癌中的阳性表达率显著低于低分化组（χ2=11.917，P<0.01），在Ⅱa、Ⅰb期的阳性表达率显著高于Ⅰa期宫颈癌组织（χ2=6.574，P<0.05），有盆腔淋巴结转移组阳性表达率显著高于无淋巴结转移组（χ2=6.235，P<0.05）。两者在不同临床病理类型间的表达差异均无显著性（P>0.05）。见表2。表2  RKIP、NFκB p65在宫颈癌组织表达及其与临床病理因素的关系（略）

    2.3  宫颈癌组织RKIP与NFκB p65蛋白表达的相关性
   
　　Spearman等级相关分析显示, RKIP表达与NFκB p65的表达呈明显负相关(r=-0.464,P<0.01)。见表3。表3  宫颈癌组织RKIP与NFκB p65蛋白表达相关性（略）
   
　　3  讨论
   
　　已有研究显示, RKIP参与细胞内多条信号转导通路的调节,具有抑制Raf1MAPK、NFκB信号通路和激活G蛋白信号转导通路活性的作用[46], 而这些信号转导通路的异常活化与肿瘤发生发展密切相关,提示RKIP表达异常参与了肿瘤发生发展。KELLER等[9]研究结果表明，RKIP是前列腺癌的转移抑制基因，在转移的前列腺癌细胞中，RKIP的mRNA和蛋白表达水平均低于非转移的前列腺癌细胞，特别是在良性组织中RKIP表达水平最高，而在转移的肿瘤组织中表达减少甚至检测不到。表明RKIP功能的丧失与前列腺癌的转移呈正相关[7]。FU等[7]报道，上调前列腺癌细胞中的RKIP表达能使癌细胞的体外侵袭能力降低、降低前列腺癌裸鼠移植瘤的转移能力。因此，RKIP现已被用作前列腺癌的一个新的诊断标志物[10]。SCHUIERER等[11]报道在转移的黑色素瘤中RKIP表达水平显著下降；超表达RKIP可以抑制高转移性黑色素瘤细胞的转移能力。在乳癌中也有相似报道[12]。提示RKIP参与了肿瘤转移的调控，RKIP功能的丧失能增强转化细胞的浸润能力，从而促进转移的发生。本研究结果显示，RKIP在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织的阳性表达率分别为29.0%、75.7%和88.9%，RKIP在宫颈癌组织中的表达率较宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织中降低，RKIP在中、高分化宫颈癌组织阳性表达率显著高于低分化者，在Ⅱa、Ⅰb期的阳性表达率显著低于Ⅰa期宫颈癌组织，在有盆腔淋巴结转移组的表达率显著降低，差异有显著意义。表明RKIP表达的减少或缺失与宫颈癌的组织分化、临床分期和有无转移密切相关，RKIP参与了宫颈癌的发展、侵袭和转移。
   
　　NFκB最主要的组成形式为p65/ p50 异源二聚体, 正常情况下, NFκB在胞浆中与其抑制物IκB结合形成无活性的复合物。IκB激酶即IKK, 被TNFα、IL1、负链RNA病毒、抗原和其他病毒感染等激活后可磷酸化IκB,进而IκB降解释放出NFκB转移入核启动靶基因(如cyclin D1、cmyc和抗凋亡基因等)转录表达。当NFκB 被过度激活,定位于细胞核而不能返回细胞质时, 与细胞核内特定基因启动子区域位点结合，启动靶基因转录，影响细胞增殖、凋亡，参与肿瘤的发生、发展。
   
　　RKIP参与了NFκB信号通路的调控[6]。抑制RKIP能增强NFκB的转录，而过表达RKIP能减少NFκB p65基础水平的转录。这种作用不依赖丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路。RKIP能与NFκB 激活途径的4种激酶NIK(NFκB inducing kinase)、TAK1(TGFβ activated kinase1)、IKKα(IkB kinase α)和IKKβ(IkB kinase β)相互作用， 还可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的NFκB抑制物激酶活性，从而抑制NFκB激活。
   
　　本文结果显示，在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中NFκB p65表达率逐渐升高，而临床期别越高、分化程度越低的宫颈癌组织NFκB p65表达率越高，有淋巴结转移组的宫颈癌组织较无转移组表达率高，RKIP与NFκB p65表达呈显著负相关。提示RKIP表达下调或缺失与宫颈癌的侵袭和转移有关，RKIP表达减少或缺失可能通过上调NFκB的表达促进宫颈癌侵袭和转移。但其具体的作用机制还有待进一步研究。对RKIP的深入研究有可能为肿瘤治疗提供新的靶点。 

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