实验性精索静脉曲张大鼠睾丸氧化应激水平的检测

【摘要】  　　目的 测定青春期精索静脉曲张(VC)大鼠睾丸组织中氧化应激水平，探讨VC致不育的机制。方法将40只雄性青春期Wistar大鼠随机分为VC 8周组、VC 12周组（各12只）和相应的假手术对照组（各8只），通过部分结扎左肾静脉建立实验性大鼠VC模型，对照组只游离左肾静脉不结扎。分别于术后8、12周解剖动物，测左侧精索静脉最大直径；比色法测睾丸组织内过氧化氢(H2O2）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（TAOC）水平。结果 成功建立了VC模型。VC 8周组和12周组大鼠左侧精索静脉均明显扩张（t=7.19、6.86,P<0.01），双侧睾丸组织内H2O2含量较对照组明显增加（t=2.31～4.78,P＜0.05、0.01），与右侧相比左侧增加更明显（t=2.56、3.15,P＜0.05）, 并且左侧VC 12周组比VC 8周组增加更明显（t=2.16，P＜0.05）。VC 8周组和VC 12周组左侧CAT活力与对照组比较显著降低（t=2.23、3.03,P＜0.05、0.01），右侧数值有下降趋势但差异无显著性（t=0.95、1.41,P＞0.05）。VC 8周组和VC 12周组双侧SOD活力和TAOC与对照组比较均明显降低（t=3.29～4.72,P＜0.01），并且VC 12周组比VC 8周组降低更明显（t=2.80、3.38,P＜0.05、0.01），TAOC左侧睾丸比右侧下降更明显（t=11.66、7.54,P＜0.01）。结论 VC可引起双侧睾丸H2O2增加，CAT活力、SOD活力以及TAOC下降，导致睾丸组织内氧化应激系统失衡。

【关键词】  精索静脉曲张；睾丸；氧化性应激；大鼠，Wistar

　　DETECTION OF TESTICULAR OXIDATIVE STRESS LEVEL IN   EXPERIMENTAL VARICOCELE IN RATS

　　JIA YUEFENG, WANG XINSHENG, MA ZHENG, et al

　　(Department of Urology,  The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,  Qingdao  266021, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To detect the level of oxidative stress in testis of experimental adolescent varicocele in rats and study its mechanism of  infertility.  Methods A model of varicocele was created in 24 adolescent male Wistar rats by partially ligating the left renal veins, which were equally randomized to group A and group B (varicocele for 8 and 12 weeks, respectively).  Eight rats underwent shamoperation and another eight served as a control group received only a dissection of the left renal vein. The animals were dissected at 8 and 12 weeks after surgery and the maximum diameter of the left spermatic veins measured, levels of H2O2, CAT, SOD and TAOC of the testes checked biochemically.  Results A model of varicocele was successfully created. Compared with the corresponding control groups, the diameter of the left spermatic veins were significantly enlarged (t=7.19,6.86;P<0.01)；the levels of H2O2 in both testes of groups A and B significantly increased (t=2.31,P<0.05；t=3.59,4.78,P<0.01), that of the left side increased more (t=2.56,3.15;P<0.05) and that in group B was much higher than that in group A(t=2.16,P＜0.05). Activity of CAT of left testes in groups A and B more reduced than that of the controls (t=2.23,P＜0.05；t=3.03,P＜0.01), while that of the right testis had a downturn but with no statistical significance (t=0.95,1.41;P＞0.05). Levels of SOD and TAOC of the bothside in both varicocele groups were lower than that of the control (t=3.29-4.72,P＜0.01), and more remarkable reduction was seen in group B than in group A (t=2.80,P＜0.05；t=3.38,P<0.01), the TAOC of the left testis was lower than that of the right (t=11.66,7.54;P<0.01).  Conclusion Varicocele induces the increase of H2O2 content of both testes, decrease of vigor of CAT, SOD and TAOC, resulting in disbalance of oxidative stress response system in testis.
   
　　［KEY WORDS］ varicocele; testis; oxidative stress; rat, Wistar
   
　　精索静脉曲张(VC)是男性不育的常见病因，其并发不育的发病率约在15％～40％ 之间。迄今为止VC所致不育的病理生理仍不十分清楚, 当前有许多种理论用来解释其机制,包括睾丸温度升高、 代谢毒素反流、 性激素抑制、 活性氧学说、 一氧化氮学说、 低氧和能量代谢障碍、 附睾功能受损、 免疫学因素、 感染因素等。本文通过建立青春期大鼠VC模型研究VC中氧化应激水平的变化，探讨VC致不育的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组
   
　　纯系健康青春期（约7周龄）雄性Wistar大鼠40只，体质量（185±15）g，由青岛市药检所实验动物学部提供。随机分为实验组（VC组）24只，对照组16只。然后将实验组又分为8周组和12周组，各12只；对照组又分为8周组和12周组，各8只。分笼同一条件饲养，室温（20±2）℃，每日光照14 h、黑暗10 h,任意饮水，标准饲料喂养。

　　1.2  VC模型建立
   
　　水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，无菌操作下取腹正中切口打开腹腔，找到左侧精索精脉并测定精索静脉近肾静脉端外径，在左精索内静脉和左肾上腺静脉内侧、下腔静脉外侧分离左肾静脉（2.0±0.3）mm，用30丝线穿过左肾静脉，将直径为0.8 mm的光滑空针针头置于左肾静脉之上，将其和肾静脉一并结扎，小心拔出针头，使肾静脉复通，造成左肾静脉的部分狭窄。对照组只行左肾静脉分离，不结扎。

　　1.3  检测指标和方法
   
　　分别于VC 后8周和12周麻醉解剖大鼠，显露双侧肾脏和精索内静脉，用带目镜测微器的手术显微镜测左侧精索静脉最大外径，若观察到左侧精索静脉明显曲张（>0.5 mm）且双侧肾脏体积相似，表明模型建立成功，建模失败的大鼠不列入统计。经腹取出双侧睾丸，使用电子天平准确称取一定量的睾丸组织，加9倍生理盐水制成组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清，按试剂盒（均购自于南京建成生物技术有限公司）说明步骤用比色法测睾丸组织中过氧化氢(H2O2）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（TAOC）水平。

　　1.4  统计学处理
   
　　应用PPMS 1.5[1]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，数据间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  各组左侧精索静脉外径比较
   
　　本实验40只大鼠，除1只因麻醉过深死亡、2只术后1～2 d死亡、2只因左侧精索内静脉扩张不明显外，实验组有19只可见左侧精索内静脉明显扩张，16只对照组大鼠均无精索内静脉扩张，两组大鼠双侧肾脏大小均相似。VC 8周组和VC 12周组左侧精索静脉的外径分别为(0.65±0.14)mm和(0.69±0.16)mm,相应对照组左侧精索静脉外径分别为(0.26±0.06)mm和(0.28±0.05)mm，两组比较差异有显著性（t=7.19、6.86,P<0.01）。

　　2.2  各组 H2O2、CAT、SOD和TAOC水平比较
   
　　VC 8周组和VC 12周组大鼠双侧睾丸组织内H2O2含量均较对照组增加（t=2.31～4.78,P<0.05、0.01），与右侧相比左侧增加更明显（t=2.56、3.15,P＜0.05）, 并且左侧VC 12周组比VC 8周组增加更明显（t=2.16，P＜0.05）。VC 8周组和VC 12周组左侧CAT活力比对照组降低（t=2.23,P＜0.05；t=3.03,P＜0.01），右侧数值已有下降趋势但差异无统计意义（t=0.95、1.41,P＞0.05）。VC 8周组和VC 12周组双侧睾丸SOD活力和TAOC与对照组比较均明显降低（t=3.29～14,72,P＜0.01），并且VC 12周组比VC 8周组降低更明显（t=2.80,P＜0.05；t=3.38,P＜0.01），TAOC左侧睾丸比右侧下降更明显（t=11.66、7.54,P＜0.01）。见表1。 表1  各组大鼠睾丸组织中H2O2、CAT、SOD和TAOC检测结果比较(略)
　
　　3  讨论
   
　　VC是男性不育的主要原因之一[2]，其发病机制仍在探索中。已有研究结果显示，多种致病因素对VC的病理变化及男性生育有影响，其中包括睾丸局部温度升高、CO2蓄积、精索静脉压力过高、毒素反流、性腺激素抑制、自身免疫、活性氧机制、一氧化氮机制、凋亡异常增加等。
   
　　氧自由基可以破坏机体细胞。在生理条件下，机体内可产生少量的氧自由基，但这些氧自由基能迅速被体内的抗氧化酶系统消除，不会产生损伤作用。抗氧化能力在男性生殖系统功能的调节中具有重要作用，它能对抗超氧化物、一氧化氮、H2O2等对睾丸生精功能及精子生活内环境的损害，其能力降低势必造成防御体系的减弱，以致形成少精、精子质量差、死精，从而导致不育。

　　本实验中由于左肾静脉回流受阻而导致了左侧VC，左侧精索静脉外径明显增粗，说明成功建立了VC模型。本实验结果显示， VC 8周组和VC 12周组左右侧睾丸H2O2较对照组均增加，左侧更明显，而左侧睾丸组织CAT比相应对照组明显减少，右侧数值有所降低，但差异无统计学意义；VC 8周组和VC 12周组左右侧睾丸组织内SOD和TAOC比相应对照组均明显降低，并且TAOC在VC 12周组比VC 8周组降低更明显，而SOD在VC 12周组与VC 8周组比较差异无显著性，TAOC在左侧睾丸比右侧下降更明显。DE STEFANI 等[3]将20只大鼠分两组，一组行左肾静脉部分结扎，另一组只游离不结扎，术后3个月测睾丸质量并切片染色行组织病理学分析，两组未见明显差别，但部分结扎组一氧化氮较对照组明显增加。王世平等[4]将215例不育病人根据有无VC分为A、B两组研究，结果显示，两组的精浆中性α糖苷酶含量均明显低于有生育能力的正常对照组,并且随着VC程度的加重,中性α糖苷酶的活性逐渐下降。MOSTAFA等[5]对176例（其中生育健康者45例，有VC但有生育者45例，无VC但不育者44例，有VC并且不育者42例）分析显示，与生育健康者相比其余3组精浆中H2O2和丙二醛等明显升高，而SOD、CAT、维生素E和维生素C等抗氧化剂明显降低。OZBEK等[6]检测15例VC不育与10例正常生育男性精索静脉和肱静脉血中SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx），结果显示VC组精索静脉内SOD和GSHPx明显低于肱静脉，并且低于正常生育男性组，而正常生育男性组精索静脉和肱静脉内SOD和GSHPx无明显差异[5]。这些研究与本实验结果基本一致，说明VC组抗氧化的防御体系受到破坏，不但过氧化物含量增加，而且酶促体系中SOD和CAT等活力降低，总抗氧化能力亦降低，并且随着发病时间的延长而更加严重。在生理情况下活性氧族的产生与对抗活性氧的酶清除系统处于一种平衡状态，这对于维持生精过程有重要意义。由于人的精子膜上磷脂富含不饱和脂肪酸，易受活性氧的过氧化损害。本实验中左侧睾丸内H2O2增加，对抗活性氧的酶清除系统的CAT、SOD和TAOC没有相应升高反而下降；而右侧睾丸可能由于与左侧睾丸存在丰富的交通支而受到一定影响，活性氧的产生与对抗活性氧的酶清除系统失衡，故活性氧产生毒性作用引起精子膜脂质过氧化，使其形态改变、功能及代谢异常，形成不同程度的精子过少、形态异常、运动障碍及不成熟精子的数量增加等，从而导致男性不育。
   
　　此外，LOPES等[7]采用TUNEL技术检测在过量活性氧条件下人的精子DNA 的完整性，结果显示活性氧可损伤精子DNA，产生异常增多的DNA片段，影响精子的发育、成熟，而抗氧化剂可抑制这种DNA损伤。SMITH 等[8]对55名VC病人与25名正常生育男性精浆中活性氧含量与DNA损害的程度研究显示，氧化损伤与这些病人精子DNA损伤相关，进一步说明了精浆内活性氧可对精子DNA产生破坏，从而引起男性不育，而抗氧化剂可能抑制这种精子DNA损伤，降低男性不育的发生。本研究对大鼠实验性VC模型进行了初步观察和研究，认为VC可引起双侧睾丸H2O2增加，CAT、SOD活力以及TAOC下降，导致睾丸组织内氧化应激系统失衡，从而可能影响睾丸生精功能，引起生育能力下降。进一步对抗氧化剂在VC中作用进行研究，可能为临床治疗VC改善病人生育能力提供一个方向。

【参考文献】
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　　[2]　ASEI R, SARIKAYA S, BUYUKALPELLI R, et al. The effects of experimental varicocele on testicular histology and fertility in monarchic adult rats[J]. U Int, 1999,83：493497.

　　[3]　DE STEFANI S, SILINGARDI V, MICALI S, et al. Experimental varicocele in the rat: early evaluation of the nitric oxide levels and histological alterations in the testicular tissue[J]. Andrologia, 2005,37(4):115118.

　　[4]　王世平,王新生,王浦,等. 精索静脉曲张不育病人精浆中性α糖苷酶及果糖水平检测[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(2):151155.

　　[5]　MOSTAFA T, ANIS T, IMAM H, et al. Seminal reactive oxygen speciesantioxidant relationship in fertile males with and without varicocele[J]. Andrologia, 2009,41(2):125129.

　　[6]　OZBEK E, CEKMEN M, SIMSEK A, et al. Comparison of antioxidant enzyme activity in the internal spermatic vein and brachial veins of patients with infertile varicocele[J]. Int Urol Nephrol, 2008,40(3):679683.

　　[7]　LOPES S, JURISICOVA A, CASPER R F. Gametespecific DNA fragmentation in unfertilized human oocytes after intracytoplasmic sperm injection[J]. Hum Reprod, 1998,13(3):703708.

　　[8]　SMITH R, KAUNE H, PARODI D, et al. Increased sperm DNA damage in patients with varicocele: relationship with seminal oxidative stress[J]. Hum Reprod,2006,21(4):986993.