稳定转染靶向bcl2的shRNA对胃癌SGC7901细胞株增殖影响

【摘要】  　　目的 探讨稳定转染靶向bcl2的小发夹RNA（shRNA）对胃癌细胞株SGC7901的长效影响。方法构建针对bcl2的shRNA质粒表达载体，转入SGC7901细胞，筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养。RTPCR方法检测稳定转染后SGC7901细胞bcl2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响。结果 稳定转染shRNA后，SGC7901细胞的bcl2 mRNA表达明显下降；细胞增殖能力及凋亡率无明显变化。结论 稳定转染shRNA能长效抑制SGC7901细胞bcl2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据。

【关键词】  基因,bcl2；RNA干扰；小发夹RNA；转染

　　EFFECTS OF STABLY EXPRESSING shRNA TARGETED TO bcl2 ON MULTIPLICATION OF SGC7901 CELLS IN GASTRIC CANCER

　　LIN MINGGANG, SHEN FANGZHEN, XIAO WENJING, et al

　　(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To explore the longterm effect of stable expression shRNA targeted to bcl2 on SGC7901 cells in gastric cancer.   Methods A shRNA expression vector targeting bcl2 was created and transfected into SGC7901 cells, the cells with stable transfection were screened and continuously cultured. The expression of bcl2 mRNA of SGC7901 and its effects on cell multiplication and apoptosis were detected by RTPCR.  Results After stable transfection with shRNA, the expression of bcl2 mRNA in SGC7901 cells fell dramatically, but the changes of cell reproductive activity and apoptosis were not significant.  Conclusion Stable transfection of shRNA has longterm inhibition on expression of bcl2 mRNA in SGC7901 cells, which provides an experimental evidence for further study of gene therapy.
   
　　［KEY WORDS］ gene, bcl2; RNA interference; small hairpin RNA; transfection
   
　　生物靶向治疗作为近几年新兴的肿瘤治疗方法,具有高效低毒的特点。研究表明，bcl2基因是一种独立的耐药基因和抗凋亡基因,能提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性。RNA干扰(RNAi)是双链RNA诱导的真核生物特异性基因表达抑制现象，应用RNAi在治疗某些恶性肿瘤中已初步显示了较理想的效果[13]。RNAi方式有多种, 其中应用质粒介导RNAi瞬时转染时抑制基因表达的作用弱，持续时间有限；转染之后利用质粒的抗药性筛选出能够稳定表达小发夹RNA（shRNA）的细胞株, 实现靶基因的稳定沉默，可方便地研究靶基因的功能而无需每次转染。本研究经G418筛选后获得稳定沉默细胞,比较其与亲本细胞及瞬时转染细胞生物学特性的差异,为后续实验提供依据。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂
   
　　胃癌SGC7901细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所； 脂质体 Lipofectamine 2000及总RNA提取试剂购自Invitrogene公司；RTPCR试剂盒购自大连宝生物公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司；上下游引物由上海生物工程有限公司合成。

　　1.2  方法

　　1.2.1  靶向bcl2基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1／GFP／Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列EST同源的序列，最后选择出4条片段作为bcl2基因干扰片段，并设计1条乱序非编码片段作为阴性对照，分别为：位于35～55 bp的GGGAGATAGTGATGAAGTACA，位于354～372 bp的GCTGCACCTGACGCCCTTC，位于435～455 bp的GAGGATTGTGGCCTTCTTTGA，位于527～550 bp的GGATGACTGAGTACCTGAACCGGC，阴性对照为GTTCTCCGAACGTGTCACGT。设计完成后送上海生物工程有限公司合成,得到的重组质粒分别命名为pGPH1／GFP／Neobcl2 shRNA1、pGPH1／GFP／Neobcl2 shRNA 2、pGPH1／GFP／Neobcl2 shRNA3、pGPH 1／GFP／Neobcl2 shRNA4及pGPH1／GFP／NeoshNC。经上海英骏生物技术有限公司进行测序,显示载体构建正确[4]。

　　1.2.2  细胞培养及转染 

　　胃癌SGC7901细胞株采用含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI1640培养基，置37 ℃、含体积分数0.05的CO2细胞培养箱中常规培养，细胞汇合度为90%时，以2.5 g/L的胰酶消化传代，按Lipofectamine 2000说明书方法进行转染。实验分为：shRNA 1～4组：分别转染特异性质粒pGPH1／GFP／Neobcl2 shRNA 1～4；阴性对照组：转染非特异性质粒pGPH1／GFP／NeoshNC；空白对照组：未转染质粒。
1.2.3  RTPCR检测bcl2 mRNA的表达  收集以上6组细胞，提取细胞总RNA。取RNA 5 μL，合成cDNA，再进行PCR扩增。bcl2引物序列：上游引物5′GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG3′,下游引物5′GGTGCCGGTTCAGGTACTCA3′, 扩增产物长度为116 bp;同时选取GAPDH作为内参照,GADPH 引物序列：P1上游引物5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′,P2下游引物5′TGAAGTCAGAGGAGACCACC3′, 扩增片段长度长为407 bp。PCR反应参数：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33个循环最后；72 ℃延伸7 min。扩增产物以15 g/L的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。目的条带采用凝胶成像分析系统分析，测定各条带的灰度值，以bcl2与GAPDH 条带灰度值的比值作为bcl2 mRNA 的相对表达水平。bcl2 mRNA表达的抑制率=(1-实验组bcl2 mRNA 相对表达水平／空白对照组bcl2 mRNA相对表达水平)×100％。为验证稳定转染后对bcl2 mRNA抑制的稳定性,本研究分别在转染细胞克隆后第15、30、45天收集细胞按上述方法检测bcl2 mRNA的表达。

　　1.2.4  筛选稳定表达shRNA质粒的细胞株 

　　选择成功瞬时转染bcl2 shRNA质粒且基因沉默效应最佳的SGC7901细胞，分别经400、800 mg/L的G418培养液递增筛选稳定表达细胞株。

　　1.2.5  MTT法检测胃癌SGC

　　7901细胞增殖  转染前1 d使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化计数SGC7901细胞，以1×104个细胞/孔接种于96 孔板，待细胞融合达90%以上时进行转染。每组设5个复孔，转染24、48、72 h后进行MTT 实验。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，培养箱孵育4 h后吸出上清液，每孔加0.05 mL二甲基亚砜(DMSO)，待孔底紫色结晶物完全溶解后，以多功能酶联检测仪于570 nm波长处测定吸光度(A)值,实验结果取每组5个复孔吸光度平均值。细胞增殖抑制率(%)=（1- A处理组/A未处理组）×100%。

　　1.2.6  细胞凋亡检测 

　　收集各实验组SGC7901细胞, 调整细胞的密度为1×108/L。根据BD公司凋亡检测试剂说明书上的方法进行凋亡检测和细胞周期分析，凋亡细胞的比例由Cell Quest Pro 软件计算。

　　1.2.7  统计学处理 

　　采用SPSS 14.0及PPMS1.5[5]统计软件进行统计处理。数据以±s表示，均数的比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  shRNA转染对SGC7901细胞bcl2 mRNA表达的影响
   
　　转染72 h后分离各组细胞的总RNA 进行RTPCR测定，结果显示，shRNA 1～4组的bcl2基因mRNA表达均有不同程度下降,其中以shRNA 2组下降最为明显,下降达80.7%，说明bcl2基因的表达已被显著抑制。

　　2.2  不同转染时间对bcl2基因mRNA表达影响
   
　　转染24、48、72及96 h时，分别提取各转染组细胞的总RNA进行RTPCR测定。结果显示，随转染时间的延长，实验组的bcl2基因mRNA表达水平逐渐下降,72 h时表达率最低,96 h时抑制率稍升高,但与72 h时比较无明显差异。

　　2.3  稳定筛选后不同培养时间对细胞bcl2基因mRNA表达的影响
   
　　瞬时转染组、稳定转染15 d组、稳定转染30 d组、稳定转染45 d组bcl2 mRNA的表达分别为(20.19±0.12)%、(22.23±0.58)%、(24.80±0.19)%与(23.45±0.35)%,各时间组间比较差异无显著性(P>0.05)。

　　2.4  不同转染方式对SGC7901细胞增殖的影响
   
　　与对照组相比,稳定转染shRNA 2质粒的SGC7901细胞的生长速度和倍增时间无明显变化；瞬时转染组的生长速度稍慢,倍增时间延长,但差异没有统计学意义（图1）。

　　3  讨论
   
　　RNA干扰现象本身是生物进化过程中细胞的一种保护性机制，机体可因此避免外源性基因(如病毒、转座子)在宿主细胞内表达，清除一些生命发育过程中出现的异常mRNA。由于RNA干扰能够高效特异地阻断目的基因的表达，已成为研究基因功能的良好工具，在肿瘤基因治疗试验研究中的应用渐多[68]。
   
　　本实验结果显示，shRNA瞬时转染具有良好靶基因的沉默作用，转染后72 h内随时间延长，抑制率增加，96 h抑制率呈下降趋势。由于瞬时转染中对细胞增殖的影响因素较多,且瞬时转染由于表达载体的排斥，随时间延长未转染shRNA的细胞增多，以及由于shRNA的降解，导致基因抑制时间缩短，抑制率偏低。有实验显示，利用不同的载体系统进行RNAi,可以避免瞬时转染的缺点,实现靶基因的稳定沉默表达,达到建立基因敲除细胞或转基因动物模型的效果[911]。利用质粒含有的抗生素抗性筛选出稳定表达shRNA载体的单细胞克隆，加以纯化扩增，得到稳定抑制目的基因的细胞株，在抗生素的维持下，在较长的时间内可以持续稳定地抑制目的基因的表达，且影响因素要明显少于瞬时转染，更能接近实际情况，其长效性和稳定性在肿瘤基因治疗中具有更大的意义和更广阔的前景。
   
　　bcl2是一种细胞凋亡抑制基因，多项实验结果提示，抑制bcl2基因的表达，能够降低癌细胞的增殖，并促进其凋亡，但各项实验的结果不尽相似。本实验结果显示，在瞬时转染实验中，bcl2基因表达的抑制率在一定的时间范围内（72 h）随时间的延长而提高，最高抑制率高于稳定转染组，且细胞增殖的抑制率、凋亡率与bcl2基因表达的抑制率相关。而稳定转染组中，bcl2基因表达的抑制率稍低于瞬时转染组，且在一定的时间范围内（本实验为45 d）抑制率比较稳定。但是bcl2基因表达的抑制率与细胞增殖的抑制率、凋亡率并不平行。显示细胞增殖基本相同，抑制率稍高于正常细胞，但没有统计学差异。究其原因，可能有以下几方面：首先，瞬时转染过程中的转染试剂对细胞有毒性作用，有可能对细胞的增殖及凋亡产生影响；其次，由于细胞信号调控机制的复杂性，稳定转染的细胞适应了bcl2基因的低表达；最后，bcl2基因并不是惟一的与细胞增殖和凋亡相关的基因。由于增殖和凋亡调控的复杂性，单独bcl2基因的抑制对细胞增殖和凋亡的影响是有限的。
   
　　本实验利用RNAi技术，比较了在胃癌细胞株SGC7901中抑制bcl2基因的表达。实验结果表明，瞬时转染与稳定转染结果不尽相同，提示shRNA有长效抑制靶基因表达的作用，但其具体机制可能与瞬时转染有差异。该实验为后续的实验提供了理论基础，并为进一步探讨RNAi的长效作用机制提供了依据。

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