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【摘要】 目的 研究人结直肠癌组织中cmet蛋白的表达及与微血管密度（MVD）的关系，并探讨其临床意义。方法 采用免疫组化SP 法检测50例结直肠癌组织、50例正常黏膜组织及20例结直肠腺瘤组织中cmet蛋白的表达以及CD105 标记的MVD。结果 cmet蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显高于结直肠腺瘤组织与正常黏膜组织(χ2=31.929,P<0.01)。结直肠癌组织中MVD明显高于结直肠腺瘤和正常黏膜组织(H=92.435,P<0.01)。结直肠癌组织cmet蛋白表达和MVD与肿瘤部位、组织学分级无关，而与Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移及远处转移密切相关（χ2=4.000～9.018，t=2.605～4.024，P<0.05、0.01），cmet阳性表达的结直肠癌组织中MVD显著高于cmet 阴性者(t=2.752，P<0.01)。结论 cmet在结直肠癌的侵袭与转移中可能发挥着重要作用，联合检测cmet的表达及MVD可能有助于结直肠癌预后的判断。
【关键词】 结直肠肿瘤；原癌基因蛋白质cmet；微血管密度；免疫组织化学
THE EXPRESSION OF cmet AND ITS ASSOCIATION WITH TUMOR ANGIOGENESIS IN COLORECTAL
CANCER ZHANG KESHUANG, KONG XINJUAN, ZHAO QINGXI, et al
(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;
［ABSTRACT］ Objective To explore the expression of cmet protein and its relation with microvessel density (MVD) in colorectal carcinoma and assess their clinical significance. Methods Immunohistochemical staining was used to detect the expression of cmet protein and MVD marked by CD105 in 50 cases of colorectal carcinoma, 20 of adenoma and 50 of normal tissue. ResultsThe positive rate of cmet in colorectal carcinoma was significantly higher than that in adenoma and normal tissue (χ2=31.929,P<0.01). The MVD in colorectal carcinoma was significantly higher than that in adenoma and normal tissue (H=92.435,P<0.01). cmet and MVD had no correlation with tumor site and histology staging, but were closely related to Dukes staging, depth of invasion, lymph node and distant metastasis (χ2=4.000-9.018;t=2.605-4.024;P<0.05,0.01). The MVD in cmetpositive rectal cancer was higher than that in cmetnegative (t=2.752,P<0.01). Conclusion cmet possibly play an important role in invasion and metastasis of colorectal carcinoma. Codetection of cmet and MVD might be conducive to prediction of the prognosis of this malignancy.
［KEY WORDS］ colorectal neoplasms; protooncogene proteins cmet; microvessel density; immunohistochemistry
结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居恶性肿瘤的第3～5位[1]，其发生发展涉及多基因的改变和多阶段的过程。原癌基因cmet的编码产物是肝细胞生长因子（HGF）的细胞跨膜受体，属酪氨酸激酶受体，包括3个功能不同的结构域，即胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。cmet基因表达及结构的异常与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关。为保证恶性肿瘤无限制侵袭性生长，肿瘤必须依赖持续和广泛的新生血管形成。本实验采用免疫组化技术分别检测结直肠癌、结直肠腺瘤及正常黏膜组织中cmet 蛋白的表达以及CD105 标记的微血管密度(MVD)，探讨其与结直肠癌临床病理因素的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本
2009年1—7月，选取青岛大学医学院附属医院手术切除的结直肠腺癌新鲜标本50例。所有病人术前均未应用放疗和化疗，其中男30例，女20例，平均年龄（62.72±10.58）岁。每例标本均采集肿瘤组织及切缘正常组织。结直肠腺瘤组织标本20例为结肠镜检标本或手术切除标本,其中男12例，女8例，平均年龄（45.36±7.38）岁。以上标本均经病理证实，经40 g/L中性甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片备用。
1.1.2 试剂
兔抗人cmet多克隆抗体工作液、鼠抗人CD105单克隆抗体工作液及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 检测方法
采用免疫组织化学二步法检测cmet和CD105在各组织中的表达，操作严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.2.2 结果判断
①cmet:主要定位于细胞胞浆，呈棕黄色。高倍镜下(400倍)至少选择5个视野，计数阳性细胞，并计算阳性细胞百分率。阳性细胞数<25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。染色程度根据多数细胞的呈色反应为准，不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。根据cmet染色程度与阳性细胞数评分之和综合判断：0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（），5～6分为强阳性（）。② CD105: 阳性染色的微血管呈棕黄色至深棕色，按WEIDNER等[2]的方法并稍改进计数MVD。高倍镜下(400倍)选择5个视野，观察并选择微血管最多的区域，计数其内的血管数目取平均值。
1.3 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，两组总体均数的比较采用独立样本t检验，多组均数的比较采用KruskalWallis检验；各组间阳性表达率比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 cmet 蛋白表达
cmet主要表达在结直肠癌细胞的细胞浆中，呈棕黄色。在结直肠癌、结直肠腺瘤和正常黏膜组织中，cmet的阳性表达率分别为76.0%(38/50)、40.0%(8/20)和20.0%(10/50)。结直肠癌组织cmet阳性表达率明显高于结直肠腺瘤、正常黏膜组织(χ2=31.929，P<0.01)。
2.2 MVD检测
CD105标记的微血管呈棕褐色。结直肠癌、结直肠腺瘤以及正常黏膜组织MVD分别为14.05±6.59、4.90±3.19、0.73±0.93，差异有统计学意义(H=92.435，P<0.01)。
2.3 结直肠癌组织cmet蛋白表达与MVD之间的相关性
cmet蛋白表达阳性的结直肠癌组织MVD为15.41±6.83，表达阴性的癌组织MVD为9.77±3.15，两者比较差异有极显著意义(t=2.752,P<0.01)。
2.4 cmet和MVD与结直肠癌病人临床病理参数的关系
结直肠癌组织中cmet蛋白表达及MVD的水平与肿瘤位置、分化程度、大小及病人的性别、年龄无关，但与肿瘤浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移及远处转移有关。见表1。表1 cmet蛋白表达及MVD与结直肠癌临床病理因素的关系（略）
3 讨论
cmet基因是1984年COOPER等首先发现的一种原癌基因，是细胞生长、分化的重要调节者。在生理情况下，cmet受体和肝细胞生长因子短暂结合发挥生理效应。大量研究表明，在人的许多肿瘤组织中有cmet 基因和蛋白过表达,如胃癌[3]、胰腺癌[4]、白血病[5]、肺癌[6]等。本研究表明，cmet在结直肠癌组织中的表达较腺瘤和正常黏膜组织显著增强,且均与肿瘤的浸润深度、Dukes分期、淋巴转移及远处转移密切相关，说明结直肠癌中cmet 的表达能促进肿瘤细胞的扩散和转移,提示cmet 表达与结直肠癌的不良临床病理参数有重要关联，cmet阳性的结直肠癌更易发生浸润及转移。李宏武等[7]研究表明，cmet高表达组淋巴转移多，说明浸润转移机会大,与本研究结果基本相符。亦有研究表明，cmet 基因表达反映结直肠腺瘤不典型增生的演变程度[8]。结直肠腺瘤为癌前病变，由正常细胞出现不典型增生，说明cmet蛋白与结直肠腺瘤早期恶变过程中的发生和发展密切相关，cmet基因可能是结直肠癌发生的早期基因改变之一。在本研究中，结直肠腺瘤 cmet蛋白表达比正常结直肠黏膜细胞高，但二者之间差异无统计学意义，可能由于本研究标本数太少，或cmet基因并未完全翻译成蛋白，从而无cmet蛋白表达明显增强。生理情况下，cmet蛋白在胚胎发育、组织损伤修复中起作用，正常细胞中cmet蛋白呈低表达或不表达。本实验结果显示，正常黏膜cmet表达率20%，考虑到实验中所用正常标本取自肿瘤病人，为相对正常黏膜组织，部分正常黏膜亦可能出现损伤，所以认为cmet可能参与细胞损伤修复过程。在病理情况下，cmet则呈持续过度表达，形成正反馈自分泌途径，导致肿瘤的无限生长和侵袭行为。
近年来大量的研究已证实,恶性肿瘤的生长、侵袭、远处转移与肿瘤血管的生成密切相关。肿瘤微血管生成是影响肿瘤预后的重要的独立危险因素。研究发现，CD105 主要表达在各组织血管内皮细胞表面,但其并非泛血管标记，它能较特异性地代表新生血管，是一种较CD34、CD31、vWF 等传统内皮标记因子更好的新生血管内皮细胞标记物，因其在活化增殖的内皮细胞表面的高表达，故更适用于肿瘤新生血管的研究。以CD105为标记计数MVD是评价肿瘤血管形成较为理想的指标[9]。本研究显示，MVD在结直肠癌组织中较腺瘤组织和正常黏膜显著增加，与肿瘤的Dukes 分期、浸润深度、淋巴结转移及远处转移密切相关，因此我们认为肿瘤的微血管数量是肿瘤病人的危险因素,数量越多预后越差,越容易发生转移。本研究中cmet阳性的结直肠癌组织中MVD值远高于cmet阴性者，提示cmet 参与肿瘤血管生成的调控，可能促进肿瘤血管生成，参与肿瘤的发生、发展及转移，两者在肿瘤血管生长的调节机制中可能存在协同关系。由于cmet在结直肠癌中的重要作用，通过某些分子途径来抑制cmet的过度表达并阻断HGF/SFcmet系统的配对表达或信号转导可作为抗肿瘤侵袭和转移治疗的策略之一，阻断作用不仅能够抑制肿瘤生长，还能够抑制肿瘤的转移[10]。
综上所述，cmet蛋白表达水平和MVD可作为结直肠癌发生、发展、浸润和转移的参考指标，并为结直肠癌的预后判断提供参考依据。已有从外周血检测cmet作为早期诊断胃癌的报道[11]。因此，联合检测结直肠癌组织cmet表达及MVD有助于判断肿瘤的恶性程度和肿瘤病人的预后。
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