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Zhang Shaofang，Liu Jiebo，Yuan Shaoqun
Depantment of Pediatrics，Luohu Hospital，Shenzhen518001.
【Abstract】 Objective To explore the protective effect and mechanism of Baicalin on injury induced by LPS in astrocytes of rat.Methods Rat astrocytes were cultured in vitro，and cell viability was assayed by MTT about the effect of Baicalin on normal astrocytes and the astrocytes treated byLPSTheconcentration of NO 2- /NO 3- in superˉnatantwas evaluatedbyspectrocolorimeter.NO 2- /NO 3- are assayed by spectrophotometer.RT-PCR was used to measure the expression of iNOS mRNA.Results There were no influences on the cells viability of astrocytes cultured with different concentrations（5μmol，10μmol，20μmol）of Baicalin during72hours.Baicalin attenuated cell viability of astrocytes treated by LPS at72th hours and have dose-effect correlations.5μmol10μmol，20μmol concentration of Baicalin decreased the excretion of NO 2- /NO 3- produced by astrocytestreatedbyLPS.BaicalininhibitedtheexpressionofiNOSmRNAinastrocytestreatedbyLPS.Conclusion Protective effect of Baicalin on astrocytes from LPS inˉjury may be related to decreasing the expression of iNOS mRNA.
Key words baicalin inducible nitric oxide synthase mRNA astrocytes
黄芩苷（Baicalin）是中药黄芩的主要有效成分之一，属于黄酮类化合物，有抑菌、抗炎、抗变态反应、抗氧化反应等药理作用。以往对黄芩苷的研究过程中发现，在整体动物实验中该药可以下调大鼠感染性脑水肿脑组织中异常增高的核转录因子κB的活性，从而减轻脑组织的损害 ［1］ 。同样也可通过抑制NF-κB的活性保护活性氧对离体的神经细胞（包括神经元、星形胶质细胞）的损害。从而说明黄芩苷能够调节细胞内激活的NF-κB的活性。新近发现NF-κB激活位点有一个位于iNOS基因的起动因子 ［2］ ，如NF-κB激活则细胞持续表达iNOS ［3］，产生较多的NO。因而我们推测黄芩苷可能抑制由脂多糖诱导的iNOS基因的表达，从而减少NO导致的神经胶质细胞的损伤。
1 材料与方法
1.1 试剂与实验设备 黄芩苷（纯度98%，分子量446.35）;DMEM培养基、Poly-L-Lysine、MTT、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、HEPES、DMSO、兔抗GFAP多克隆抗体、胎牛血清、DNA Mark参见第一部分。逆转录酶、RNA酶抑制剂购于美国Promega公司，5×buffer，OligT，10×PCR buffer，MgCl 2 ，dNTP，Tag酶，琼脂糖凝胶均购于上海生物工程有限公司。CO 2 培养箱（Ikemorira-Kogyo），医用净化工作台（YJ-1450型），倒置相差显微镜（Olympus），脉动真空蒸汽灭菌器（XMG-1.2），全自动酶标仪（Bio-Tek Instruments Inc Elx800），PCR仪（USA U600型），凝胶成像分析系统（Engle Eyell）。
1.2 方法
1.2.1 新生大鼠星形胶质细胞培养方法 取出生1天内Sprague-Dawley大鼠，无菌条件下取出前脑，置D-Hanks液中，去除血污，仔细剥除脑膜和表面血管。将脑组织移入无菌小瓶，剪碎，加入0.25%胰酶，37℃消化15min，吸取多余的胰酶溶液，加入含20%FCS的培养液（DMEM高糖型培养基，另含HEPES10mmol/L，谷氨酸2mmol/L，胰岛素4U/L，青霉素105U/L，链霉素100mg/L）灭活胰酶，并反复吹打制成单细胞悬液。将悬液移入离心管，200g离心10min，吸取上层，然后加入适量的培养液，再次小心吹打制成细胞悬液，通过200目钢网过滤，调整细胞密度至1×10 6 /ml，然后接种至培养瓶（涂鼠尾胶）或培养板（涂多聚赖氨酸）。在37℃，饱和湿度，5%CO 2 /95%空气的CO 2 培养箱中培养。1.2.2 黄芩苷对胶质细胞存活率的影响 神经胶质细胞接种至96孔板，每孔接种含相应密度的细胞（1×10 4 /ml～1×10 5 /ml）。把黄芩苷分5组，设1组空白对照，其余4组黄芩苷干预浓度为5μM，10μM，20μM，40μM，每组内10～12个样本。加入已含10%血清的培养基中，培养72h，用MTT方法观察细胞的存活情况。
1.2.3 不同黄芩苷浓度对LPS组胶质细胞活力的影响 在已培养细胞密度为1×10 4 ～1×10 5 /ml培养板中，均加入LP（100mg/L），设为LPS组。其余3组分别用黄芩苷处理30min后加入LPS。黄芩苷按3种浓度（5μM，10μM，20μM）分为3组（简称Bai1，Bai2，Bai3组）。每组内样本为10～12例，连续干预72h。吸取每孔上清-20℃保存留做NO 2ˉ /NO 3ˉ 测定，然后进行细胞活力的检测。
1.2.4 NO 2- /NO 3- 的测定 测定上述4组AC上清的NO 2- /NO 3- 的含量。NO 2- /NO 3- 的测定试剂盒购于晶美生物工程有限公司，以NaNO 2 为测定标准品，实验步骤按试剂盒说明书。
1.2.5 iNOS mRNA的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法
1.2.5.1 AC核内mRNA的提取 用细胞刮刮取（5～10）×10 6 AC置入1.5ml的EP管中2000g离心10min，去上清液后加入1ml的Trizol，用Tip头轻轻打匀细胞。加入200μl的氯仿，混匀15s后，在室温中放置2min。然后在12000g，4℃离 心15min。可见液体分层。取上清液，加0.5ml异丙醇，室温10min后11000g，4℃离心15min。去上清，用1ml75%乙醇（0.1%DEPC）洗涤1次，混匀，然后7500g，4℃离心15min。去上清，晾干15min。加入0.1%DEPC去离子水20μl打匀，在55℃～60℃水浴10min。紫外分光光度计测所提RNA的OD值。并放置-70℃保存以防RNA降解。根据所测样本的OD值，提取2μg RNA加0.1%DEPC水至12.5μl。在PCR仪上70℃放置5min，冰上骤冷。在短暂离心后加入5buffer4μl，OligT1μl，RNA酶抑制剂50U，DNTP1μl，逆转录酶20U，PCR仪上42℃60min，945min，然后冰上骤冷。-20℃保存。取2.5μl产物cDNA加入5μl10×PCR buffer，3μl MgCl 2 ，DNTP2μl，iNOS的上、下游引物各50pmol/L，内参GAPDH上、下游引物各10pmol/L，Tag酶1μl，补双蒸水（1/1000DEPC）至50μl，混匀，短暂离心后加入30μl的无菌轻质液状石蜡。放置PCR仪中，按下述反应条件进行PCR。PCR反应条件:首先95℃、5min，然后95℃、30s，退火温度56℃、45s，延伸温度72℃，30s。共35个循环。然后72℃10min总延伸。PCR产物在含有5μg/ml EB的1.2%琼脂糖凝胶下100V电泳，在Engle Eyell凝胶成像分析系统分析DNA的含量。GAPDH为参照基因，以iNOS与GAPDH DNA含量的比值为细胞内iNOS mRNA含量的相对值。1.2.5.2 引物序列 见表1。
表1大鼠iNOS与GAPDH的引物序列表(略)
2.6 统计学方法 以上数据均以均数±标准差（ˉx±s）表示。SPSS10.0统计软件包进行统计学分析。多组之间比较方差分析，两两之间比较用q检验。两两相关用直线相关分析，P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 黄芩苷对细胞活力的影响 本实验观察在24、48、72h观察，发现5μmol、10μmol、20μmol浓度的黄芩苷与对照组比较对细胞活力无影响（P>0.05，n=12），40μmol黄芩苷对细胞活力有影响（P<0.05，n=12）。
2.2 不同黄芩苷浓度对脂多糖组细胞活力的影响 三种不同浓度的黄芩苷（按浓5μmol，10μmol，20μmol浓度简称Bai1，Bai2，Bai3组）预处理后:LPS对AC活力的影响结果发现，Bai1，Bai2，Bai3组能恢复炎症组导致的AC活力下降（F=3.697，P<0.05）。其细胞活力的恢复与黄芩苷干预浓度有量效关系。见表2。
2.3 NO 2- /NO 3- 的测定结果 测定发现随黄芩苷浓度的增加，NO浓度逐渐下降。NO的浓度与细胞活力呈负相关（r=-7.35，P<0.001）。见表3。
表2 不同黄芩苷浓度对脂多糖作用AC活力的影响 （略）注:与LPS组比较 ˇ P<0.05，与LPS组比较 # P<0.01
表3 黄芩苷不同浓度对LPS诱导AC分泌NO浓度测定 （略）
2.4 脂多糖对AC iNOS mRNA的表达及不同黄芩苷浓度对其影响 AC正常组iNOSmRNA的表达，而在脂多糖干预后iNOS mRNA的表达明显增多。黄芩苷可以抑制脂多糖 所致的AC iNOS mRNA的表达（P<0.05，n=5），有量效关系。以20μmol浓度对iNOS mRNA表达抑制最明显。通过DNA灰度扫描给RT-PCR所得电泳条带定量，以iNOS mRˉNA目的片断与GAPDH片断之间比值做比较，发现四组之 间差异有非常显著性（F=5.97，P<0.01）。见表4。
表4 黄芩苷浓度对脂多糖刺激后iNOS mRNA RT-PCR影响 （略）注:与LPS组比较 ˇ P<0.05，与LPS组比较 # P<0.01
3 讨论
本研究在培养的AC加入5μM，10μM，20μM，40μM四种浓度的黄芩苷共同培育，以了解是否对正常的细胞有毒副作用。MTT分析是一种评价药物作用与细胞增殖的常用方法，通过MTT分析发现黄芩苷在较高剂量40μM时对细胞的增殖有抑制作用，而5μM，10μM，20μM时对AC增殖无影响，与宋元宗等［4］ 得到的结果基本一致。故实验中用5μM，10μM，20μM三种浓度的黄芩苷预处理AC并与脂多糖共同培养。正常的神经细胞不表达iNOS。多数炎症因子可影响iˉNOS的表达，它们主要作用于转录水平。LPS可诱导AC NO合成 ［5］ ，主要与iNOS mRNA的表达增多有关。应用黄芩苷可减少NO的分泌与它能抑制iNOS mRNA的表达有关。NO的增多在神经系统感染性疾病、脑缺血与出血、神经退行性病变的发生发展中占有重要的地位 ［6，7］ ，抑制其表达可减少神经系统损害。我们的实验发现NO浓度与细胞活力呈负相关，从而说明了NO可能导致了细胞功能的损害。黄芩苷减轻LPS对细胞活力的影响与它抑制了iNˉOS mRNA可能有关。
参考文献
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（收稿日期:2004-05-11）
（编辑元 红）
作者单位:518001广东省深圳市罗湖医院儿科