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【摘要】 目的 探讨大鼠急性脊髓损伤（SCI）后不同时段髓内诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA动态表达。方法 36只SD大鼠随机分组，任选一组作为对照。采用Allen法制作急性脊髓损伤模型，在损伤后2，6，12，24，48h等时段，以反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）分析iNOS mRNA表达。在SCI后24h，用免疫组化方法分析iNOS在脊髓不同类型神经细胞中的表达与分布。结果 脊髓损伤后，神经元、星形细胞和小胶质细胞中均可见iNOS表达，以神经元表达为主。SCI后2h可见iNOS表达0.56±0.02，24h达高峰1.20±0.05，48h开始降低0.70±0.06。结论 研究资料提示SCI后脊髓内iNOS表达增高，过量产生的NO加重了继发性脊髓损伤。
Tang Jian，Shi Hongguang，Zhao Jian
Department of Orthopaedics，Haimen People’s Hospital.Jiangsu226001.
【Abstract】 Objective To explore the expression of induced nitric oxide synthase（iNOS）mRNA in spinal cords after acute spinal cord injured（SCI）in SD rats.Methods Expression of iNOS-mRNA in injured spinal cords was detected by RT-PCR after the2nd，6th，12th，24th，48th h after injured with Allen’s weight-dropping model.The distribution of iNOS was examined by immunohistochemistry in tissues of spinal.Results The iNOS expression was observed first at2h，peaked at24h，and decreased at48h after injury.The iNOS immunoreactive cells were neuˉrons，astrocytes and microglia cells.The tendency of the alterations of NO and NOS were the same with iNOS-mRˉNA.Conclusion The present data suggest that NOS gene expression was increased after spinal cord injured and over-production of NO may promoted the secondary spinal cord injury.
Key words
脊髓损伤（SCI）后组织代谢产物中部分有一定毒性而加重了组织损伤，此为继发性损伤，涉及到微循环、水肿、神经递质、离子改变、一氧化氮（NO）、血管内皮素、细胞凋亡等诸多方面。自由基和血管机制在脊髓损伤后的病理发展过程中的作用近年来越来越受到重视 ［1，2］ 。NO是近年来发现的一种活跃的小分子自由基，具有神经毒性。大量研究表明:NO及其合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）在中枢神经系统损伤中发挥着重要作用 ［2］ ，损伤后iNOS表达的确切机制尚未阐明。本研究观察脊髓损伤后iNOS在脊髓不同细胞中的定位及其iNOS的基因表达，探讨iNOS在脊髓继发性损伤中的作用及意义。
1 材料与方法
1.1 实验对象 健康成年SD大鼠36只（南通医学院实验动物中心提供），质量220～300g，雌雄不拘，以抽签法随机分为:无损伤组，损伤后2，6，12，24，48h组，每组6只。损伤组大鼠以10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，严格无菌操作下，取后正中切口，切除胸T 9～10 椎板，暴露硬膜囊，依Nystrom等的方法后路压迫脊髓（35.0g×10min），无损伤组仅行硬膜囊暴露而不损伤脊髓。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化标记 用常规免疫组化方法标记神经元（小鼠抗NSE-IgG，1∶100，NeoMarker）、星形胶质细胞（小鼠抗GFAP-IgG，1∶100，NeoMarker）和小胶质细胞（GSA-IB4耦联的小鼠IgG，4g/L，Sigma）。用抗小鼠免疫组化试剂盒（ABC法，Zymed SP-9002）检测，DAB显色。苏木精复染，常规脱水封固。
1.2.2 iNOS扩增引物合成 所用PCR引物由上海生工生物有限公司合成，iNOS引物:5′-GTG TTCCACCAGGAGATˉGTTG-3′（上游），5′-CTCCTGCCCACTGAGTTCGT C-3′（下游），其扩增产物长576bp;β-actin引物:5′-GTTCGCCATGˉGAT GACGATATC-3′（上游），5′-GCCAGATCTTCTCˉCATGTCGTC-3′（下游）。扩增产物265bp。
1.2.3 组织总RNA提取 依不同的实验分组，将大鼠腹腔麻醉，严格无菌操作下，取出伤段脊髓组织100mg，以美国Promega总RNA提取试剂盒提取组织总RNA，总RNA提取后以紫外分光光度计测定A260:A280比值，重复3次，测得该比值稳定于1.8～2.0，计算总RNA含量。
1.2.4 反转录（RT）-PCR扩增iNOS-mRNA 取4μg总RNA，70℃变性5min置冰上，依次加入10mmol/L dNTP，0.5g/L Oligo dT，40U反转录酶（m-mulv）和pH8.3的5×缓冲液（250mmol/L Tris-HCl，250mmol/L KCl，20mmol/L MgˉCl 2 ，50mmol/L DTT），以去离子水补至总反应体积为20μl，37℃反应1h后，70℃加热10min结束反应。取2μl反转录反应液，分别加入2mmol/L dNTP，20pmol/L寡核苷酸引物，2UTaq DNA聚合酶，5×缓冲液，去离子水补至25μl。PCR反应的变性、退火和延伸温度分别为:93℃、58℃和72℃，反应时间分别为45s、45s和1min。共进行32个循环。首次循环前94℃2min，末次循环72℃10min。反应完成后，取PCR产物iNOS7.5μl+β-actin7.5μl的cDNA，行15g/L琼脂糖电泳，凝胶以美国GDs7600凝胶扫描分析系统行吸光度扫描，计算出NOS基因表达量与其相对β-actin表达量的比值。
1.3 统计学方法 数据以ˉx±s表示，由南通医学院统计学教研室采用SPSS10.0软件进行t检验。
2 结果
2.1 iNOS在不同类型细胞中的分布 急性SCI后损伤中心脊髓变扁，表面可见7.0～8.0mm长血肿。损伤中心内可见组织坏死、破碎。邻近组织可见中央管淤血，灰质内多发局灶性出血，白质中也可见到少量出血灶。脊髓损伤后，神经元、星形细胞和小胶质细胞中均可见iNOS表达，以神经元表达为主。
2.2 SCI后iNOS扩增结果 急性SCI后2h，脊髓组织即可扩增出iNOS mRNA，其基因扩增片段长度为576bp。（图1）
图1 SCI后iNOS扩增结果（略）
2.3 SCI后不同时段iNOS mRNA的表达 SCI后不同时段iNOSmRNA的表达水平见表1。iNOS mRNA于无损伤组中未测得表达，伤后2h组开始表达，并于24h组达高峰，与2h组相比差异有非常显著性（表1）。
表1 脊髓损伤后不同时段iNOSmRNA的表达（略）
注:与伤后2h组相比 a P<0.05; b P<0.01
3 讨论
SCI发生后组织代谢产物中部分有一定毒性而加重了组织损伤，此为继发性损伤，涉及到微循环、水肿、神经递质、离子改变、NO、血管内皮素、细胞凋亡等诸多方面。研 究脊髓继发损伤的因素，从而中和或对抗其毒性，以减轻伤情是目前临床工作治疗的重点 ［3］ 。近年来的研究中，自由基在脊髓继发性损伤发生、发展过程中的作用日益受到重视。NO作为一种活跃的小分子自由基，其生物学作用广泛而多样，在病理条件下可以对组织造成损害。无论在脑损伤还是脊髓损伤模型中，这种损伤作用都得到证实 ［4］ 。对截瘫患者的血清NO的检测结果同样提示其在脊髓损伤过程中的作用 ［5］ 。
体内NO由NOS生成，后者广泛存在于包括中枢神经系统在内的全身各系统中。在生理条件下，nNOS和eNOS维持NO于相对的低水平，在炎症、创伤等条件下，iNOS则可大量产生NO，经由过氧化机制或介导其他介质而产生损伤。为进一步研究NO的作用，本实验主要从分子水平上检测大鼠脊髓损伤组织中iNOS mRNA的表达变化情况。结果显示iNOS自损伤后2h开始表达，但初期升高缓慢，后期则显著升高，24h时达峰值。该结果显示，损伤后NOS活性立即升高可能是对创伤和缺血刺激的一种保护性反应，其NO的作用可能是”保护”性的，以改善缺血组织的血供，防止组织损伤的进一步发展。iNOS在生理时未表达，只在损伤的后期才有明显升高的表达，提示其NO的作用应不在于生理调节，而很可能是一种损伤机制，参与SCI过程。同时，在脊髓组织免疫组化研究中观察到iNOS表达。在急性SCI后iNOS免疫活性分布在神经元、星形细胞和小胶质细胞中。最近有报告SCI后iNOS免疫阳性细胞出现在巨噬细胞和血管周围细胞中 ［6］ 。在脑损伤后也发现脑内存在iNOS阳性脑血管平滑肌细胞、中性粒细胞及星形细胞。这些都表明多种细胞参与了急性SCI后继发性病理过程中iNOS的表达和相关的发病机制，该结果与其他学者的研究相符 ［7］ 。iNOS产生的NO则可能通过自分泌或旁分泌的方式在继发损害的过程中起作用。
中枢神经系统损伤后iNOS表达的确切机制尚未阐明。在病理条件下iNOS基因被诱导活化合成iNOS蛋白。一旦iNOS表达，其产生的NO将保持相当高水平并持续较长时间。NO是活泼的自由基，与超氧化物结合可生成具更高毒性的过氧化物硝酸根阴离子。这些分子具有高细胞毒性，它们能造成脂质膜损伤、抑制细胞能量代谢和DNA的合成修复，并引发细胞凋亡和坏死，而iNOS在后者中可能起了更大作用。已证明脊髓空洞化主要是活化的星形胶质细胞释放NO所致 ［8］ 。本研究中SCI继发损伤的机制可能是挫伤引起局部血流减少、组织缺氧并引起潜在的神经毒性细胞因子释放，从而诱导各种细胞iNOS表达，局部NO升高，对周围组织产生继发性损害效应。
结论:在急性SCI后iNOS表达增高，具有时间依赖性，定位于以神经元为主的多种细胞中。由此产生的NO大量增加可能是加重脊髓继发性损伤的重要因素之一，但针对性的抑制iNOS的治疗有待进一步探讨。
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作者单位:226100江苏省海门市人民医院骨科
226001江苏省南通医学院附属医院骨科