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Ultrastructure analysis of osteoblasts and adipose cell derived from mesenchymal stem cell
Liu Jinhua，Ru Yongxin，Zhong Shu
Institute of Hematology and Blood Disease Hospital，CAMS and PUMC，Tianjin300020.
【Abstract】 Objective To analysis osteoblasts and adipose cell derived from mesenchymal stem cell from skeletal musclea，lung，dermis and bone marrow of fetus.Methods Separate and abstract the mesenchymal cell，select CD105positive cell byMACS，then induce these cells to transform into osteoblasts and adipose cell in culture.Results The cells from fate skeletal muscle，lung，dermis and bone marrowwere transformed into osteoblasts and adipose cell，which shara the typical features of real osteoblast containing high dense calcium salts and adipose cell containing fatty droplets under transmission electron microscopy.Conclusion The CD105positive mesenchymal stem cells have the capability of differentiation into osteoblats and adipose cells.
目前，国内外还少有评价诱导的成骨细胞和脂肪细胞的超微结构的相关报道。本文主要分离胎儿骨骼肌、肺脏、血管、骨髓的间充质干细胞，对其诱导的成骨细胞和脂肪细胞的超微结构进行分析，从而为组织工程的应用提供新的检测指标。
1 方法
1.1 分离人胎儿各组织CD105 + 细胞 分别取胎儿主动脉血管、骨骼肌、肺脏，去掉周围结缔组织，用D-Hank's液冲洗后，剪成小块，经0.2%胶原酶37℃消化45min后，用0.1%胰酶消化45min。经过细胞筛过滤后离心，接种在培养瓶中培养。待细胞融合约80%后，消化细胞传代。胎儿骨髓间充质干细胞培养方法见 ［1］ 。另外，用MACS磁珠分选CD105 + 细胞。
1.2 诱导CD105 + 细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化 将分选后的CD105 + 细胞以2×10 4 个细胞接种在3.5cm 2 的培养皿，1×10 5 个细胞接种在25cm 2 的培养瓶中，24h后，一组改为脂肪诱导培养液（10%FCS，10 -6 M地塞米松，100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤，50μg/ml抗坏血酸，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）。同样，另一组转换为成骨诱导培养液（10%FCS，10 -7 M地塞米松，50μg/ml抗坏血酸，10 -2 β-磷酸甘油）分别向脂肪和成骨细胞诱导，细胞每3天换一次液。
1.3 透射电镜检测诱导的成骨细胞和脂肪细胞的超微结构 当诱导的成骨细胞出现钙盐沉积或脂肪细胞出现脂肪泡以后，将细胞离心10min（1500r/min），用0.1MPBS（pH7.2）洗2遍，加入6%戊二醛固定2h（4℃），0.1MPBS（pH7.2）洗2遍，1%锇酸固定2h，丙酮梯度脱水，环氧丙烷过渡、环氧树脂Epon812包埋，60℃聚合，超薄切片机切片，枸橼酸铅、醛酸铀双染色，日立H-600电镜观察。
2 结果
2.1 诱导的成骨细胞超微结构 诱导的成骨细胞大体与正常组织的成骨细胞的超微结构一致;细胞外间质成分有钙盐沉积于胶原纤维中。胞浆中有一定量的粗面内质网和高尔基复合体，此外还可见溶酶体及线粒体，线粒体中有电子致密颗粒，所不同的是在胞浆内线粒体外也有电子密度高的钙盐沉积，有的细胞钙盐沉积体积较大，可能会影响细胞的弹性或功能。（图1、2、3）。
2.2 诱导的脂肪细胞超微结构 诱导的脂肪细胞超微结构类似于正常的脂肪细胞:脂肪细胞质膜表面有基膜，基膜外有薄层胶原纤维紧贴。含有大的脂类内含物，脂滴内无任何细胞器。核周胞质较为丰富，其中含有较多的线粒体和少量粗面内质网。也见高尔基复合体、溶酶体等细胞器，有时还可见糖原颗粒。基本上和脂肪细胞的超微结构类似。但在诱导的脂肪细胞和细胞外见到的脂滴有一层膜包围。细胞外的脂滴有的膜已不存在，有可能将其内的脂类释放出来。（图4、5、6）。（本文图片见附页1）
3 讨论
胎儿和出生后个体的不同组织中可以分离到具有自我更新、多向分化潜能和增殖特性的细胞，目前将具有此类特征的细胞称为成体干细胞。成体干细胞突破性的进展在于其具有的分化为其他组织细胞的可塑性特征，即不仅可以跨系分化，甚至还能够跨胚层分化。成体干细胞的可塑性现象引起了许多科研工作者的兴趣。而间充质干细胞是最近几年成体干细胞研究的特点之一。间充质干细胞不仅能分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞和软骨细胞，还可以分化为脂肪细胞、成骨细胞，显示了间充质干细胞的多向分化潜能 ［2～6］ ，说明间充质干细胞在再生医学中有着广阔的应用前景。间充质干细胞作为种子细胞在组织工程中得到应用。在支架材料包被种子细胞体外诱导分化为组织细胞如软骨细胞、成骨细胞的生物材料将会应用到临床。因而，体外诱导的组织细胞的正常结构应该是评价生物材料的重要指标之一。目前研究证明，具有间充质干细胞特征的细胞存留在机体的各组织器官中 ［7，8］ 。我们的观察结果证实成体血管、肌肉、骨髓等都含有间充质干细胞特征的细胞，都可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，在透射电镜下观察到成体各组织中的CD105 + 细胞转化为脂肪细胞的胞体中含有大的脂滴，并逐渐增多最终可溢出细胞外，这可能是血脂增高、脂肪肝、肥胖等发病的另一重要原因。同时，我们在电镜下还观察到成体格组织器官的CD105 + 细胞诱导分化后形成的成骨细胞内有钙盐沉积及骨针结构，线粒体中的电子致密颗粒主要是磷酸钙。细胞外间质成分有无机质骨盐，已结晶的羟基磷灰石和无定形的胶体磷酸钙的形式分布于有机质中。有机质的主要成分是胶原纤维，羟基磷灰石分布于胶原纤维中，使骨组织具有抗压性和弹性。细胞外间质成分胶原纤维中也有钙盐沉积，可能会影响细胞的弹性和功能，从而使各组织器官逐渐失去弹性而变硬。
参考文献
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作者单位:300020天津中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院