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Wang Xianyuan，Xu Zhiqin，Zhang Yuehong，et al.
Institute of Hygiene and Environmental Medicine，Military Medical Science Academy，Tianjin300050.
【Abstract】 Objective To study the effect of epimedium on activity of rat osteoblast in vitro.Methods Osˉteoblast，derived from skull digested by trypsin and collagenase from natal rat，were added epimidium to study multipliˉcation，intake of 3 H-proline and activity of ALP.Results Multiplication，ALA activity and intake of 3 H-proline were increased in different extend in every experimental group.Conclusion Epimidium could boost up activity of osˉteoblast.
Key words epimidium osteoblast 3 H-TdR 3 H-Pro ALP
骨质疏松是一种全身性的骨代谢疾病，它的主要特征是成骨细胞活性降低、骨量减少、骨的微观结构退化、骨脆性增加、易于发生骨折及其并发症 ［1］ 。淫羊藿是中医及食疗中常用的补肾主力，具有祛风湿、强筋骨功效。现代研究表明，淫羊藿明显促进骨髓细胞蛋白质合成与核酸代谢 ［4］ ，促进试管内鸡胚股骨生长 ［5］ 。此外临床应用还发现含淫羊藿的中药复方及食疗组方，具有缓解和改善部分骨质疏松症状的作用。因此，本研究试图探讨淫羊藿水提液对体外培养的乳鼠颅骨成骨细胞活性的影响。
1 材料与方法
1.1 成骨细胞培养 无菌条件下分离出生2～3天的乳鼠颅盖骨，剥离软组织和骨膜，无菌PBS冲洗，加入0.25%胰蛋白酶，37℃摇动消化20min，弃去上清液，加入0.1%的Ⅱ型胶原酶，37℃摇动消化2h，200目筛网过滤，悬液离心后所得细胞沉淀用F-12培养基（含20%胎牛血清）重悬，调整细胞浓度至5×10 8 个/L，接种于25ml培养瓶，5%CO 2 孵箱中培养，原代细胞融合成单层后，以0.25%胰蛋白酶消化，F-12培养基培养，取第三代细胞用于实验。
1.2 MTT增殖实验 96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液（5×10 5 个/ml），在37℃，5%CO 2 培养箱中培养12h，分别加入淫羊藿至终浓度为10 0 ～10 2 ng/ml，10 -9 mol/L己烯雌酚为阳性对照，以1%吐温20为阴性对照，继续培养48h和72h，在最后4h时每孔加入10μl MTT（10mg/ml），4h后弃培 养上清，每孔加入100μl二甲基亚枫，震荡10min后酶标仪读数（570nm）。
1.3 3 H-TdR掺入实验 成骨细胞加入己烯雌酚和不同浓度的淫羊藿培养48h后，每孔加入37kBq的 3 H-TdR。继续培养24h，弃上清液，用PBS洗涤，每孔加入10%的三氯醋酸100μl，放置10min，吸弃上清液，10%三氯醋酸重复洗2次，每次5min，每孔加入裂解液100μl（含0.3mol/L的NaOH和1%SDS），60℃30min，收集上述裂解液于闪烁瓶中，加2ml闪烁液（2，5-二苯基唑4g，1，4-双-2，4-甲基-5苯基唑0.1g，乙二醇乙醚375ml，甲苯625ml），芬兰Pharˉmacia-wallac1209Rackbeta液体闪烁计数仪测其放射性。
1.4 3 H-Pro掺入实验 成骨细胞用含己烯雌酚和不同浓度的淫羊藿培养液培养48h，每孔加入37kBq的 3 H-脯氨酸。继续培养24h，细胞处理同1.3，检测其放射性。
1.5 碱性磷酸酶活性测定 成骨细胞用含己烯雌酚和不同浓度的淫羊藿培养液培养72h，吸出培养液，加100μl裂解液，用试剂盒测定细胞裂解液中的碱性磷酸酶活性。
1.6 统计学方法 所有数据均以ˉx±s表示，采用t检验。
2 结果
表1提示，无论是培养48h还是72h，雌激素均能显著促进成骨细胞增殖，增加 3 H-TdR掺入。培养液中补充淫羊藿同样具有促进成骨细胞增殖的作用，但效果不如雌激素强;其中淫羊藿10ng/ml剂量效果好于其他剂量。 作者单位:300050天津军事医学科学院卫生环境医学研究所
表1 淫羊藿对成骨细胞增殖的影响 （略）
雌激素对照组成骨细胞不但ALP活性明显增强， 3 H-Pro利用也显著增加（表2）。三个淫羊藿实验组ALP活性和 3 H-Pro摄入均有增加，但只有10ng/ml和100ng/ml组ALP活性升高和 3 H-Pro摄入增加差异具有显著性（P<0.05）。
表2 淫羊藿对成骨细胞ALP活性及胶原合成的影响 （略）
3 讨论
骨形成和骨吸收是骨代谢的两个基本过程，骨质疏松症就是由于骨代谢的失衡，破骨量大于成骨量所致。给予淫羊藿，促进了体外培养的成骨细胞分裂增殖，说明成骨细胞功能活跃，骨形成增强，骨转换增加。与此同时，淫羊藿可在一定程度上抑制破骨细胞的作用 ［6］ ，从而进一步改善了骨结构，有助于防治骨质疏松。
碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸酯，增加局部无机磷的浓度，从而促进骨基质的钙化 ［7］ 。本实验结果表明，体外实验中淫羊藿不但能促进成骨细胞增殖，还能明显增加成骨细胞ALP活性，说明淫羊藿能明显促进骨基质的钙化，增强骨强度。骨组织主要由骨细胞、骨矿物质及骨基质三个部分组成 ［8］ 。除碱性磷酸酶外，有机质含量是决定骨基质钙化的重要因素。由成骨细胞合成并分泌的有机质，主要成分是骨胶原（占90%以上），而骨胶原是骨骼矿化的结构基础。在骨基质矿化过程中机体吸收的钙离子被转运至Ⅰ型胶原同非胶原蛋白相结合形成的 网状支架上，并按一定的极性排列、沉积，才能完成骨基质的钙化和成熟。作为胶原特有的氨基酸，羟脯氨酸利用率直接反应骨组织特性。我们通过 3 H-Pro掺入实验，证实淫羊藿可促进成骨细胞摄入利用羟脯氨酸，说明胶原合成增加，骨吸收和骨转换增加，促进骨基质钙化，有助于增强骨骼弹性和硬度 ［9］ 。
目前我国已进入老年社会，因衰老所致的各种疾病，尤其是骨质疏松发病率逐年上升，骨质疏松已成为影响老年人健康水平的重要因素。现有研究表明淫羊藿具有一定的防治骨质疏松作用，但是目前对其研究尚不够全面、完整和深入。针对老年社会的特点，充分利用我国的自然资源优势，进一步探讨淫羊藿抗骨质疏松的作用机制，将有广阔的应用前景。
参考文献
1 Richard D，Wasnich M D.Epidermiology of osteoporosis.Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism.NewYork:lippincott-raven，1996，249-251.
2 丁桂芝，刘忠厚，周勇.中西医结合防治骨质疏松症的基础与临床研究进展.中国骨质疏松杂志，1997，3（2）:81.
3 杨欣，郑淑蓉.骨质疏松症和激素补充疗法.中国骨质疏松杂志，2002，8（8）3:270-274.
4 刘春福，丁光霞，李菊仙.淫羊藿多糖对羟基脲所致小鼠“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率的影响.中国中药杂志，1991，16（10）:620.
5 高子范，扬宗智，马克昌，等.淫羊藿注射液对试管内鸡胚股骨生长的促进作用.中西医结合杂志，1985，5（3）:172.
6 陈坤，于世风，史风芹，等.黔岭藿对体外培养的破骨细胞作用的研究.中国骨质疏松杂志，1996，2（3）:59.
7 薛岩.骨质疏松的生化诊断.中国骨质疏松杂志，1995，1（1）:58.
8 Parfitt AM，Drezner MK，Glorieux FH，et al.Bone histomorphometry:standardization of nomenclature committee.J Bone Min Res，1987，2:595-611.
9 Melton LJ，Khosla S，Atkinson EJ.Relationship of bone turnover to bone density and fracture.J Bone Miner Res，1997，12（7）:1083-1091.
作者单位:300050天津军事医学科学院卫生环境医学研究所