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【摘要】 目的 研究前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的作用。 方法 分别以1、2、10、50、100×10 -5 g/L5种不同浓度前列通淤提取液作用体外培养前列腺基质平滑肌细胞，采用MTT和TUNEL法分别测定抗增殖指数和凋亡指数。 结果 5种不同浓度前列通淤提取液作用48h后抗增殖指数分别为50.61%、53.52%、56.92%、65.53%、72.94%，抗增殖效果随着浓度增大而增大。100×10 -5 g/L前列通淤提取液作用24、48和72h后凋亡指数与对照组比较差异无显著性。 结论 1～100×10 -5 g/L前列通淤提取液体外作用前列腺基质平滑肌细胞具有显著的抗增殖作用。
【关键词】 前列腺;平滑肌细胞;细胞凋亡;前列通淤
Effect of extracted liquid from Qianlietongyu on the proliferative or apoptosis on prostatic smooth muscle cells in vitro
CHEN Tong-wen，DENG Chun-hua，LIU Jian-zhong，et al.
Zhuhai Hospital，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangdong519015，China
【Abstract】 Objective To study the effect of extracted liquid fromQianlietongyu on the proliferative or apoptosis on prostatic smooth muscle cells in vitro.Methods After extracted liquid fromQianlietongyu treated the cultured prostat-ic smooth muscle cells，the antiproliferative index and apoptosis index were assessed by MTT assy and terminal de-oxynucleotidy transferase mediated dUTP nick end labling（TUNEL）respectively.Results There was a significant dose-effect relationship between the concentration of extracted liquid from Qianlietongyu and the antiproliferative in-dex on prostatic smooth muscle cells in vitro（P<0.01），but there was no significantly different of the apoptosis index between the group of extracted liquid from Qianlietongyu and the control group（P>0.05）.Conclusion Extracted liquid from Qianlietongyu may show significant antiproliferative effect on prostatic smooth muscle cells in vitro，without inducing apoptosis.
【Key words】 prostate;smooth muscle cells;apoptosis;extracted liquid from Qianlietongyu
中药前列通淤胶囊可显著改善排尿和前列腺压痛等症状，对前列腺疾病的治疗有一定疗效，但其作用机制尚不清楚 ［1］ 。前列腺组织包括上皮和基质（平滑肌和结缔组织）细胞成分，其中基质平滑肌细胞约占40%［2］ 。本实验研究前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的影响，旨在探讨前列通淤胶囊治疗前列腺疾病的细胞水平作用机制。
1 材料与方法
1.1 组织来源和实验材料 前列腺组织取自2001年我院经耻骨上前列腺摘除术新鲜标本，病理排除前列腺癌。主要试剂:RPMI-1640培养液（含L-谷酰胺），10%胎牛血清，1%胎牛血清，胶原酶Ⅰ型0.5g/L，青链霉素（200U/ml），二性霉素（1μg/ml），睾酮（0.05μg/ml），泼尼松（0.05μg/ml），MTT（1g/L），二甲亚砜（DMSO），兔抗人角蛋白单抗，兔抗人Actin单抗，TUNEL试剂盒等。中药前列通淤胶囊由珠海星光制药厂提供，胶囊内粉末用无菌生理盐水溶解后离心取上清液备用，预实验确定前列通淤提取液有效浓度为（1～100）×10 -5 g/L。
1.2 前列腺基质细胞的分离培养及鉴定 新鲜前列腺手术标本剪成2mm×2mm×2mm碎块，经消化离心后，沉淀不能溶解的组织和大块上皮细胞，再离心上清液，取沉淀细胞种入50ml培养瓶，在5%CO 2 、37℃条件下培养，每周更换培养液3次，取第5代对数生长期细胞实验用。显微镜下观察细胞形态变化，取第1、5代细胞行抗α-Actin、Cytoker-atin18免疫细胞化学染色，分别计算阳性细胞占总细胞数的百分比。
1.3 MTT测定细胞抗增殖指数 实验分7组，每组8个复孔，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种于96孔培养板。加入含血清培养液0.2ml，24h细胞贴壁后PBS洗2次，加入无血清培养液0.2ml，48h后细胞静止。除去上清后加入含血清培养液0.1ml，再加入1、2、10、50、100×10 -5 g/L5种浓度的前列通淤提取液0.1ml。作用48h后，吸除培养液，加入0.2ml MTT，37℃孵育4h，加入0.5%400μl的DMSO溶解形成蓝色结晶色团，振动10min。在ELX800型自动酶标仪570nm波长测定每孔内DMSO溶液的吸光度A值。抗细胞增殖指数（%）=［（对照组A值-实验组A值）/对照组A值-空白组A值］×100%。
1.4 TUNEL测定凋亡指数 实验分前列通淤提取液和对照两组，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种在24孔培养板上，每组4个复孔。加入含血清培养基1ml，24h细胞贴壁。PBS洗两次，加入无血清培养基1ml，48h细胞静止。除去上清后加入100×10 -5 g/L前列通淤提取液1ml，作用24、48、72h。按TUNEL试剂盒说明操作标记凋亡细胞，光镜（×200）下计算5个随机视野凋亡细胞数，凋亡指数（%）=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。
1.5 统计学方法 所有数据经SPSS8.0软件处理，两组以上比较采用方差分析和两两比较的q检验。
2 结果
2.1 培养前列腺基质细胞特征 显微镜下观察细胞在24h有部分贴壁生长，12d细胞几乎长满需要传代，呈典型的梭形，细胞数目增多形成细胞小结，呈现“峰与谷”的特征。免疫细胞化学染色显示第1、5代Cytokeratin18 + 上皮细胞分别占9.3%和1.7%，α-Actin + 平滑肌细胞分别占35.7%和82.3%，表明经过5～6代后已形成了以平滑肌细胞为主的前列腺基质细胞。（图1）
2.2 MTT实验 1、2、10、50、100×10 -5 g/L5种不同浓度前列通淤提取液抗细胞增殖指数分别为50.61%、53.52%、56.92%、65.53%和72.94%，5种不同浓度前列通淤提取液均具有不同程度的抗增殖作用（44.21%～82.62%），统计分析有显著差异（表1）。随着浓度增高抗增殖指数升高，呈剂量效应关系（图2）。
表1 不同浓度前列通淤提取液的前列腺平滑肌细胞抗增殖指数 （略）
注: ■ 之间和 ▲ 之间比较P>0.05，其余各组间比较P<0.01
2.3 TUNEL实验 浓度为100×10 -5 g/L的前列通淤提取液作用前列腺基质平滑肌细胞24、48和72h后凋亡指数分别为1.2%、1.7%和1.8%，对照组分别为1.3%、1.5%、和1.8%，方差分析显示各治疗组间差异无显著性。
3 讨论
我国传统中成药治疗前列腺疾病多有良方，但有关细胞水平作用机制方面的研究报道较少，这是治疗前列腺增生药物中中成药的市场占有率不高的原因之一，同时也是治疗前列腺的中成药不能走向国际市场的重要原因。国外采用植物药治疗前列腺疾病在欧洲最活跃，有的国家多达90%的前列腺增生病人采用植物药治疗。植物药治疗前列腺疾病作用机制主要有以下几方面:直接抑制前列腺的生长;抗雄激素或抗雌激素作用;降低性激素结合球蛋白的含量;改变胆固醇的代谢;干扰前列腺素E的代谢起抗炎作用等 ［3］ 。有关植物药对前列腺细胞动力学变化的研究则较少。
本研究发现浓度为（1～100）×10 -5 g/L的中药前列通淤提取液体外作用培养前列腺基质平滑肌细胞，不同浓度均有显著的抗细胞增殖作用。选择最大的抗增殖浓度100×10 -5 g/L未发现有明显的诱导凋亡作用。提示前列通淤提取液中存在抑制前列腺基质平滑肌细胞生长的有效成分。前列通淤胶囊中药方剂中的某些活性成分抑制前列腺基质平滑肌的生长可能是临床治疗前列腺疾病的细胞水平机制。大量研究发现前列腺基质细胞的生长受多种细胞因子的调节，中药前列通淤提取液调节前列腺基质平滑肌细胞的生长可能是通过调节某种或多种生长因子起作用，亦可能其活性成分本身即包含有多种生长因子，这些都值得深入研究 ［4］ 。
（本文图片见封三）（略）
【参考文献】
1 彭淑莲，贾玉森，陈和亮，等.前列通淤胶囊治疗慢性前列腺炎临床观察.中国实验方剂杂志，2000，6（4）:57-59.
2 陈辉熔，邓春华，丘少鹏，等.良性前列腺增生病人前列腺基质成分含量的变化.中华男科学，2001，7（6）:362-364.
3 Franlin CL，James CK.Phytotherapy in treatment of benign prostatic hyperplasia:a critical review.Urology，1996，48（1）:12-20.
4 Walsh PC.Campbell's Urology，Volume2，7th ed，Philadelphia，W.B.Sauders Company，1998，1433.
（编辑守 中）
作者单位:519015广东珠海，广东省中医院珠海医院男科
510080广东广州，中山大学附属第一医院泌尿外科
510080广东广州，中山大学中山医学院生物学教研室
519015广东珠海，广东省珠海市拱北医院男科