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【摘要】 目的 建立随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分型技术，对肠球菌进行基因分型，探讨RAPD在分子流行病学中的应用，并探讨肠球菌的基因分型及其与耐药性的关系。 方法 对医院临床标本中分离的64株肠球菌进行RAPD基因分型，并分析基因型与耐药性的关系。 结果 RAPD分型结果显示，经优化的RAPD分型技术能有效地对肠球菌进行基因分型，分型率为100%。64株肠球菌根据扩增片段的差异分为8种基因型。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型为主，共占81.4%。Ⅰ、Ⅷ型具有对β内酰胺类抗生素和高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅳ型具有对β-内酰胺类抗生素耐药。Ⅲ、Ⅶ具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有对β-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素敏感。 结论 RAPD分型技术是一种特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高、重复性好的分型方法。可有效地对肠球菌进行基因分型，并且肠球菌的RAPD分型与其耐药性有一定关系。
【关键词】 肠球菌;随机扩增多态性DNA;基因分型
Study on typing of enterococcus by random amplified polymorphic DNA and its application
JIANG Han-mao，XIAO Xiang-ying，ZHOU Wei-xin，et al.
Department of Laboratory Sicence，the People's Hospital of Yongzhou，Hunan425000，China
【Abstract】 Objective To establish the random amplified polymorphic DNA（RAPD）genotyping，to discuss its role in molecular epidemiology.And to investigate the correlation of genotypes of enterococcus and its phenotype of drug re-sistance.Methods Using RAPD technique to genotype from clinical isolated samples from four hospitals and to analy-sis the relationship both the phenotype and drug resistance to antibiotics.Results Results of RAPD genotyping showed that RAPD in optimized condition could be used in enterococcus genotyping with the genotyping rate was100%.32strains of enterococcus were grouped into eight genotypes based on the fragments of amplified products.The most common types wereⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅶ，with accounted for81.4%.GenotypeⅠandⅧwere drug resistant toβ-lactam antibiotics，and high-level aminoglycoside antibiotics.GenotypeⅣwas drug resistant toβ-lactam antibi-otics.GenotypeⅢandⅦwere drug resistant to high-level amioglycoside antibiotics.GenotypeⅡ，ⅤandⅥwere sensitive toβ-lactam antibiotics，high-level aminoglycoside antibiotics and glycopeptide antibiotics.Conclusion The RAPD type technique was an useful genotyping method to type enterococcus stains with specificity，sensitivity，simplicity and rapidness，powerful discrimination，high typeability，good reproduction.And there was a certain relation-ship between the RAPD genotyping of enterococcus and the phenotype of drug resistance to antibiotics.
【Key words】 enerococcus;random amplified polymorphic DNA;genotyping
肠球菌的感染和耐药性是目前国内外关注的重要课题和难点。美国疾病控制中心（CDC）医院感染监测系统（NISS）调查表明，肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一 ［1］ ，并且肠球菌的分离率不断上升 ［2］。尤其多重耐药（MDR）肠球菌的出现，特别是高水平氨基糖苷类耐药（HLAR）肠球菌以及耐万古霉素肠球菌（VRE）的出现，其耐药性和耐药水平越来越高，成为抗感染治疗的新挑战。近年来，随着分子生物学技术的发展，具有分辨力强、分型率高和重复性好的RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究 ［3］ ，并显示出较好的应用前景。RAPD分型法是1990年内Williams和Welsh等建立的一种以PCR为基础的提示基因同源性和基因多态性的方法，该法最大特点是可对模板序列未知，而随机引物可以是任意的单链寡聚核苷酸片段。同时可通过在RAPD分型的基础上，进行与其耐药性关系的研究，可在基因水平上对临床细菌的耐菌性进行测报。因此，肠球菌的基因分型鉴定对于其流行病学分析和感染控制具有重要意义。为此，我们收集临床分离的64株肠球菌进行RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究现报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株 2003年1月～2004年12月本院住院患者的尿液、痰液、大便、分泌物、胆汁、前列腺液、血液等临床标本中分离的64株肠球菌，已经系统鉴定。
1.2 细菌DNA的提取 将64株肠球菌分别接种于血平板，35℃培养18～24h。用接种环将菌落分别接种于5ml的普通营养琼脂（LB）液体培养基中，35℃恒温摇床过夜，取1.5ml菌液离心收取菌体，酚氯仿法抽提后DNA，分光光度法测定抽提后DNA的纯度，A260/A280为1.82～1.98之间，符合DNA样品要求，置-20℃冰箱保存备用。
1.3 RAPD反应体系条件的优化
1.3.1 引物的设计 RAPD引物共6条，5条为10bp的引物，1条为9bp的引物。序列15′-GAAGTCGTLL-3′，序列25′-TCACGCTGCA-3′，序列35′-GGAGGGTGTT-3′，序列45′-AGGGAACGAG-3′，序列55′-ACGCGLCCT-3′，序列65′-GGGATGGAAC-3′。由上海生工生物工程公司提供。
1.3.2 RAPD引物、Mg 2+ 浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数的反应条件优化 在50μl PCR反应体系中含被筛选的随机引物之一2μl（10pmol/L），10×buffer5μl dNTP0.4μl（0.2mmol/L），Mg 2+ 浓度1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mmol/L，Taq DNA溶酶1.5U、2.0U、2.5U、3.0U，DNA模板5.0μl循环参数94℃预变性3min后，再经94℃1min，35℃1min，72℃2min各35、40、45、50个循环后72℃延伸5min，取5μl扩增产物加上2μl上样6×buffer，经1.5%琼脂糖凝胶（内含0.5μg/ml EB染料）电泳，85～100V电泳1h，同时用DNA marker作标准，紫外分析仪下观察并拍照，进行RAPD结果比较，观察RAPD分型指纹图，确定RAPD分型技术的优化条件反应体系。
1.4 RAPD优化条件的基因分型实验方法（略）
循环参数为94℃预变性，再经94℃1min、35℃1min、72℃2min、45个循环后经72℃延伸5min。
1.5 优化条件反应体系的重复性试验 随机6株不同DNA指纹的样本在优化反应体系下重复检测3次，观察DNA指纹图谱。
2 结果
2.1 RAPD反应体系的优化
2.1.1 随机引物的筛选 每次RAPD分析加入6条随机引物之一，结果显示引物AW96628，序列3为5′-GGAGGGT-GTT-3′和引物AW96627，序列2为5′-TCACGCTGCA-3′均能对肠球菌产生特征RAPD谱型，而引物AW96628产生的RAPD指纹图谱，扩增条带最清晰，分辩率最高，为最佳引物，其它4条引物菌株出现RAPD指纹图谱，条带少，不够清晰，没有长、中、短片段分布。
2.1.2 Mg 2+ 浓度的影响 以Mg 2+ 浓度为2.5mmol/L时扩增条带最清楚，长短片段分布均匀，扩增效率最高。
2.1.3 Taq DNA聚合酶的影响 Taq DNA聚合酶为2.5U时，扩增带亮度最强，产物最多，若在1.5U时有些产物丢失，且扩增带存在模糊，其它用量单位对指纹图谱影响不大，但为便于观察和拍照，以选用2.5U为最佳。
2.1.4 循环参数的影响 以循环次数为45时，指纹图谱最 为清晰，若为35个循环扩增产物的指纹图谱几乎无法辨认。
2.2 RAPD分型谱 选用引物为AW96288，序列3，5′-GGAGGGTGTT-3′的优化体系反应条件下，64株肠球菌均产生特征指纹图谱，经归纳分析发现8种类型的DNA指纹图谱，其扩增DNA的特征片段在200～1543bp之间，各带型间有较高的相似性，8种类型分别以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ等8个英文字母表示，其中DNA指纹中Ⅰ型占15.6%（10/64），Ⅱ型占18.8%（12/64），Ⅲ型占12.5%（8/64），Ⅶ型占25.1%（16/64），其它四型均<10%。扩增带在4～8条间，其中分子量为697bp扩增带频率最大，有可能为肠球菌的特征带。见表1、图1。
表1 64株肠球菌RAPD分型谱（略）
M:DNA marker;Ⅰ-Ⅷ:8种型别肠球菌的DNA指纹
图1 肠球菌RAPD分型的8种DNA指纹（略）
2.3 肠球菌RAPD分型与其耐药性关系 RAPD分型的8种型别与β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类抗生素耐药谱的关系显示，Ⅰ、Ⅷ型具有对β-内酰胺类抗生素和高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅳ型具有对β-内酰胺类抗生素耐药。Ⅲ、Ⅶ具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有对β-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素敏感。
2.4 优化反应系条件的重复性 对6种不同DNA指纹的细菌样本的优化反应体系条件下重复检测3次，各自的RAPD指纹图基本一致，呈现良好的稳定性。
3 讨论
肠球菌不同菌种的耐药性不同，肠球菌菌种、亚种甚至基因分型的鉴定对于其流行病学及感染控制具有重要意义 ［4］ ，肠球菌的实验检查至今未有明确完善的分型方法。传统的分型方法主要有细菌素分型、噬菌体分型、生化反应类型分型、耐药谱分型和血清学分型等。但这些方法均存在着粗糙、特异性低、不稳定、费时、费力等问题，近年来随着分子生物学技术的发展，具有分辨力强、分型率高和重复性好的质粒分型，PFGE、RAPD、RFLP等技术已应用到肠球菌的基因分型和相关研究 ［3，5］ 。
RAPD是一种新兴的基因分型方法，可对细菌病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子微生物学等流行病学调查及医院感染等分析 ［6］ ，RAPD分型法是1990年由Williams和Welsh等建立的一种以PCR为基础的揭示基因同源性和基因多态性的方法，该方法的最大特点是可对模板序列未知，而随机引物可以是任意5～20个bp的单链寡聚核苷酸片段。由于采用低退火温度和随机引物，引物的筛选成为RAPD成功分型的关键。此外，镁离子浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数等因素都会对RAPD的实验结果产生影响 ［7］ 。本实验首先对RAPD反应体系中的各种因素进行优化、标准化，建立起肠球菌的RAPD分型方法进行基因分型，该方法具有特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高和重复性好等特点，在可有效地对肠球菌做基因分型，有利于肠球菌感染分子流行病学研究和探讨疾病的感染源、病原流行株的分子进化。同时还进行了肠球菌RAPD分型与其耐药性关系的研究，可以通过RAPD分型技术在型别鉴定的基础上，有望在基因水平上对临床细菌的耐药性进行测报，这在国内上尚属创新和先进的实验研究，本实验研究有较大的实用价值和应用前景。
本实验经研究选用引物AW96628行RAPD，成功地对64株临床分离鉴定的肠球菌进行分型，分型率为100%，这为肠球菌RAPD研究提供了最佳引物，有利于不同实验室进行分型的比较，结果显示，根据DNA产物片段大小和数目的不同，共分为8种基因型，各型的RAPD指纹图谱不同，表现出基因多态性。每型的RAPD指纹图谱极其相似，表现出高度同源性，特别是所有肠球菌都共有分子量约697bp片段扩增带，这可能为肠球菌的特征带，有待进一步研究证实。这说明肠球菌在遗传上既有基因多态性，也存在稳定性。本实验结果证实，本地区内RAPD分型以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型为主，共占81.4%。
由于反应体系中的关键反应成分有着一定的交互作用的影响 ［8］ ，因此反应体系的优化是RAPD研究必须进行的一项工作，只有以统一的最佳随机引物、扩增体系中Mg 2+ 浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数进行的RAPD，才能形成某一细菌RAPD分型的优化、标准化条件。引物低退火温度下，引物G+C含量在扩增效率方面有重要价值 ［9］ ，在本实验中，以G+C含量为60%的引物AW96628为最佳。Mg 2+ 浓度、Taq DNA多聚糖、循环参数的改变也影响着RAPD，本实验研究证实这些影响的存在，在RAPD分型时要尤加注意。此外，模板DNA的质量也很重要，如果其制备方法有差异，其质量就可能存在差异，在这些情况，即使使用相同 的随机引物扩增，不同方法以提取的同一种细菌DNA的RAPD指纹图谱会有很大差异。因此，要求在相同条件下制备细菌DNA。本实验细菌DNA的提取质量很好地保证了DNA的纯度。
细菌耐药表型与其基因型有密切的关系，变异机制有多种，但最重要的是基因突变，这在RAPD分型方法中可反应在DNA扩增带型的改变，如果某一基因型与某一特定的表型之间有相关，那么就可以直接通过检测该基因型来确定与之相对应的表型。Willems ［9］ 和Delvecchio ［10，11］ 等用分子生物学技术研究了肠球菌基因型和抗生素耐药基因。本实验应用RAPD分型对标本进行耐药表型分析，研究了肠球菌基因型和其耐药表型之间的关系。实验结果显示，Ⅰ、Ⅳ、Ⅷ具有对β-内酰胺类抗生素耐药表型，Ⅲ、Ⅶ型具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药表型，Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ具有对β-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素等抗生素敏感表型。基因型与其耐药菌性之间关系，有何影响，国内外尚无报道，有待进一步探讨。这一结果提示，肠球菌的临床分离菌株，在通过RAPD分型的基础上结合其耐药表型，有望在基因水平上对肠球菌的耐药性进行测报。
本实验可能由于研究收集的肠球菌本身的特性或研究菌株较少，如将在今后工作中能深入研究，相信RAPD分型技术必会对肠球菌的控制和防治工作发挥积极的作用。
【参考文献】
1 Tomayko JF，Murray BE.Analysis of enterococcus faecalis isolates from intercontinental sources by multilocus puzyme electophoresis and pulse-field gel electrophoresis.J Clin Microbiol，1995，33（11）:2903-2907.
2 Mccarthy AE.Victor G，Ramotar K，et al.Risk factors for acquiring ampicillin-resistant Enterococcui and Clinical outcomes at a Canadian tertiary-care hospital.J Clin Microbiol，1994，32（11）:2671-2676.
3 Morrison D，Woodford N，Barrett SP，et al.DNA Banding Pattern Poly morphism in Vancomycin-resistant Enterococcus faecium and criteria for defining strains.J Clin Microbiol，1999，37（4）:1084-1087.
4 Zerros MJ，Susan Donabdian，Chow JW，et al.DNA hybirdization and contour clamped homogeneous electric field electroresis for identification of Enterococci to the species level.J ClinMicrobiol，1995，33（1）:141-144.
5 Petersom LR，Connie S，Pfailer MA，et al.Comparison of genomic meth-ods for differentiating strains of Enterococcus faecium:assessment using clinical epidmiologic data.J Clin Microbiol，1998，36（11）:3327-3331.
6 Speijer H，Savelkoul PH，BoutenMJ，et al.Application of different geno-typing method for Pseudomonas a emginosa in a Tyler KD，Wang G，Tyler SD，et al.Factor affecting reliability and reproducibility of amplifi-cation based DNA finger printing of representative bacterial pathogens.J Clin Microbial，1997，35:446-449.
7 Dain RA，Abedr，Charrel，et al.Variations in DNA concentrations singnificantly affect the reproducibility of RAPD finger print patterns.Res Microbiol，1995，146:561-568.
8 Power EG.RAPD type in microbiology a technical review.J Hosp In-fect，1996，34（1）:247-265.
9 Willems RJ，Top J，Vanden BN，et al.Molecular diversity and evalution-ary relationships of Tn1546-like ellments in Enterococci from humans and animals.J Antimicrb Agents Chemother，1999，43:483-491.
10 Delvecchio VG.Rapid detection of Enterococci and antihiotil resistanc genes in urine:Approaching realtime capability.J Clin Microbiol Neusl，1998，20:192-195.
11 Setting of endmicity in an inteasive car unit.J Clin Microbiol，1997， 37:3654-3661.
（编辑李 弋）
作者单位:425000湖南省永州市人民医院检验科