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【摘要】 基因治疗正在成为常规方法难以治愈的中枢神经系统疾病的新的治疗手段。本文概要介绍了CNS基因治疗的方法和途径；CNS基因治疗的病毒载体以及目前老年性痴呆基因治疗研究与神经生长因子作用机制的状况。
【关键词】 基因治疗；老年性痴呆；病毒载体；神经生长因子
老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)是德国著名神经解剖学家和病理学家Alosis Alzheimer于1907年首先描述,后人以其姓氏命名的。老年性痴呆是以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退变性疾病。AD发病率因调查的对象、地区及标准不同而异,但有一个共同的趋势,就是随着人口年龄的增大而增多［1］。由于AD病程长,又缺乏有效的治疗方法,众多的AD病人给家庭和社会带来严重的负担。因此,寻找有效的AD治疗方法已成为医学界的紧迫课题。本文概要介绍了CNS基因治疗的方法和途径；CNS基因治疗的病毒载体以及目前老年性痴呆基因治疗研究与神经生长因子作用机制的状况。
1 基因治疗
基因治疗(genetherapy)是向功能缺陷或病变的细胞及组织引入互补的正常基因或治疗性功能基因,使其表达而达到治疗疾病的方法。中枢神经系统(central nervous system, CNS)作为一个高度独立化器官,因其独特的生理特征及细胞之间相互作用的复杂性,不易进行基因操作。近年来,由于神经遗传学研究的进展、CNS疾病发病机制的进一步阐明、导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的进步,使基因介导CNS疾病的治疗越来越趋近现实,CNS作为基因治疗的靶器官正逐步实现［2］。
1.1 基因治疗的方法和途径
1.1.1 exvivo途径 exvivo途径即体外细胞介导法,通过移植携带靶基因的工程细胞完成,是基因转移技术和脑内移植技术的结合。首先将目的基因转入体外培养的靶细胞内,进行筛选、鉴定后,行体外扩增,然后将其移植入脑内治疗靶区,使其在脑内充当分泌营养因子、神经递质和代谢酶等基因产物的生物学“微泵”(minipump),此细胞称为基因修饰细胞或工程细胞。这种方法比较经典、安全,效果较易控制,但是存在操作步骤多、技术复杂、难度大及若采用人类胚胎细胞则涉及伦理学问题,故不易推广。
exvivo途径中靶细胞的筛选是至关重要的,既要易于获得、容易转染及稳定表达,又要避免发生免疫反应。应遵循以下原则:(1)基因转导的细胞必须能长期在宿主脑内存活,且无侵袭性;(2)修饰后的靶细胞应具有稳定表达治疗性产物的能力;(3)可体外控制治疗性产物有效、适量的表达;(4)能预设某一安全机制,在必要时可激活以阻止修饰细胞在体内有害的生长和(或)有害功能的发挥,以避免肿瘤发生。目前,应用于CNS基因治疗研究的靶细胞主要有成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、条件永生性神经细胞(conditionally immortal izedneural cell)及神经干细胞。
1.1.2 invivo途径 invivo途径即体内直接转染法,是体内基因治疗的直接途径。包括:(1)非病毒介导途径即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可通过物理方法实现靶向性转移(如基因枪)等优点。但是直接导入的DNA通常难以整合入基因组,基因表达存在不稳定性,且在非分裂细胞中基因的转染效率不高,使其应用受到限制。(2)病毒载体介导途径即通过构建复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。迄今为止,病毒载体用于CNS细胞基因传递取得了许多进展,尽管其安全性及效率仍有待提高,但invivo方法已成为目前CNS基因转移的主要研究方向,只有invivo方法取得成功,CNS基因治疗才能走向临床。
1.2 CNS基因治疗的病毒载体
1.2.1 RNA病毒载体
1.2.1.1 逆转录病毒载体 逆转录病毒载体是目前研究最成熟的一类RNA病毒载体。常用的逆转录病毒载体主要来自Moloney小鼠白血病病毒。它具有以下优点：宿主范围广，能感染包括胶质细胞、神经前体细胞在内的各种分裂细胞，感染效率高；在正常生理状态下可以单拷贝的形式整合入宿主细胞基因组,并随宿主细胞的分裂而增殖；病毒与细胞结合后，病毒表面的糖蛋白即结合于细胞表面的受体，故细胞不会被同种病毒重复感染。但仍存在一些令人担忧的问题,如病毒基因组在宿主细胞染色体上的随机整合可能引起插入突变；载体在辅助细胞中有可能发生同源重组，产生具有致瘤性的野生型病毒；此外逆转录病毒载体不能感染分裂后细胞，故不能直接用于神经细胞的转导。
1.2.1.2 慢病毒载体 慢病毒(lentivirus)属逆转录病毒亚属,是一类非鼠源性逆转录病毒,以人类免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus,HIV)为代表。慢病毒源性载体(lentivirus basedvector,LV)最主要的优点是它能将外源基因整合入非分裂细胞的基因组内,对有丝分裂后神经元转基因治疗提供了一个潜在的传递系统。但其严格的宿主范围、滴度低及HIV 1独特的致病性,限制了它作为转基因载体的应用。为了最大限度降低其通过重组产生有复制能力野生病毒的可能性,重组病毒的产生采用三质粒包装系统,为了进一步增强这一系统的安全性,一种自我失活(selfinactivating,SIN)慢病毒载体最近已被构建成功。应用LV向脑内引入基因已取得了诱人的结果,转染细胞(主要为神经元)在所有时间点上均明显高于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体,而且这种载体存在长期的转基因表达,无明显免疫反应。因此LV有可能成为未来CNS基因治疗的最佳载体［3.4］。
1.2.2 DNA病毒载体
1.2.2.1 单纯疱疹病毒载体 Ｉ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virustypel ,HSV 1)含有152kb双链DNA,基因组包含80个以上基因。HSV来源载体有重组子载体(HSV RV)和扩增子载体两大类型。HSV RV含有全部病毒基因组,其中一个或多个基因已突变,以降低其毒性和提供转基因空间。最新版本HSV RV删除了多个含转录激活因子的即刻早期基因,基本消除了病毒基因的表达。HSV 扩增子载体由一个含有HSV DNA复制起点序列oris和包装信号pac的质粒组成。在HSV辅助病毒作用下被允许以串联体形式包装入HSV病毒,无HSV辅助病毒时,这些载体可以通过与一组已删除HSV基因组保留pac信号序列的粘粒或BAC质粒共转染而得到包装。这些载体的优点有:基本上无毒性或免疫原性;较大的转基因容量,通常可达22kb,最大可达150kb;相当高的滴度;对神经细胞的高度感染性,在非分裂细胞中潜伏达数月。此外,HSV载体感染神经元时,可沿着神经元突起向其胞体快速逆向运输,故可提供一种间接的靶向性基因转移途径。但HSV存在神经细胞毒性作用和免疫反应,可引起较明显的局部炎症和坏死,故HSV作为CNS转基因载体还有待于进一步研究和改进。
1.2.2.2 腺病毒载体 腺病毒(adeno virus,Ad)是目前被较广泛使用的一类DNA病毒载体,其基因组长约36kb,从左至右可分为4个基因功能区即E1 E4区。第一代复制缺陷型Ad因存在较强的宿主免疫反应,使其应用受到限制。改进后的新型Ad载体删除了表达病毒蛋白的E2ａ和E4基因或E4基因上特殊的开放性阅读框,故具有长期的转基因表达和较低的炎症反应。最近产生了一种“无内核”(gutless)、高容量的Ad载体,删除了病毒基因组所有的结构基因,仅保留了复制和包装的必需序列。这种“无内核”Ad载体具有转基因容量大、滴度高、宿主范围广,可感染分裂和非分裂细胞、感染效率高、无野生腺病毒污染等优点,在体研究已显示其长期的转基因表达活性和较低的宿主炎症反应。其另一个特点是具有随机整合人类或非人类染色体的能力,但整合效率较低,多数仍以附加子形式存在,而且已整合的载体序列容易发生重新组合。
1.2.2.3 腺相关病毒载体 腺相关病毒(Adeno associated virus,AAV)是一种缺陷型非病原性人类细小病毒,是目前发现的最小、结构最简单的DNA病毒,含有一条线状单链DNA,其复制依赖于辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)。野生型AAV能选择性整合入人类19号染色体的特定部位,建立溶源性感染。与其它基因载体系统相比较,AAV载体的主要优点有:(1)它是一种非病原性的人类病毒,与人类疾病无关；(2)AAV能感染的细胞类型范围较广,可感染分裂后细胞,转染效率极高;(3)载体中仅保存AAV的ITRs,而ITRs,基本上又是转录中性的,不干扰外源基因的表达和调控;(4)rAAV缺乏病毒基因,对超感染没有免疫原性,故可以向同一细胞引入两种不同的基因,或对同一细胞反复感染;(5)转基因可获得长期稳定的表达。新的包装技术已明显提高rAAV载体滴度,而且可排除辅助腺病毒的污染［5］。此外,可调控基因表达载体及针对不同细胞的靶向性载体的成功开发,使其应用前景更加广泛。
1.2.3 杂交型病毒载体 由于目前的病毒载体系统不能自主复制,无法达到稳定的CNS转基因表达,而反复向脑内注射载体会给患者带来较高的危险。为了使CNS转基因获得长期、稳定的表达,根据现有病毒载体的优点,将其不同的病毒元件组合而产生的杂交型病毒载体,目前正在研究、开发,主要包括HSV AAV杂交型扩增子载体、Ad EBV和HSV EBV 逆病毒杂交型扩增子载体、Ad AAV杂交型载体、Ad 逆病毒杂交型载体等几种类型。不同载体系统优缺点的客观比较少见文献报道,目前尚没有一种载体可以作为所有疾病类型转基因研究的通用工具,而且在以后的数年内也不可能出现这种万能的载体。在现阶段Ad仍可能是以短期表达为治疗目标invivo途径基因研究最合适的载体,特别是那些单次剂量就能达到临床治疗效果的方案。如能实现Ad靶向性细胞摄取及表达,降低免疫原性,无疑将扩展其用途,但不适合慢性疾病的长期治疗。在未来的几年里,AAV可能是功能缺陷蛋白长期替代治疗最常用的载体［6］。
2 老年性痴呆基因治疗概况
2.1 老年性痴呆 AD患者脑内主要的病理生理改变有两大特征:第一是皮质、海马及皮质下区等多个部位出现广泛性的老年斑和神经纤维缠结;第二是神经元变性和丢失及突触数量的减少,其中基底前脑胆碱能神经元变性和丢失最为明显。基底前脑胆碱能神经元与AD患者的学习和记忆功能密切相关,因此挽救基底前脑胆碱能神经元的存活和减少其突触的丧失是治疗AD的关键。基底前脑胆碱能神经元是神经营养因子敏感细胞,其表面有神经营养因子受体,给基底前脑胆碱能神经元损害的大鼠脑内提供外源性神经营养因子,能够保护胆碱能神经元免受损害,可以促进损伤的神经纤维再生长,并且大鼠的学习和记忆能力也有明显的改善［7.8］。
2.2 老年性痴呆的基因治疗 AD基因治疗的早期策略是向脑内移植遗传修饰后的能产生NGF的自体同源细胞或神经前体细胞［9］。除了神经营养因子外,还可以通过神经递质的恢复和替代方法治疗AD,胆碱乙酰基转移酶(Cholineacetylase,ChA)是脑内乙酰胆碱合成的限速酶,AD患者脑内存在ChA活性下降,乙酰胆碱合成减少。转导ChA基因,提高乙酰胆碱合成,可治疗AD。最近,Saille等［10］研究发现,表达人类抗凋亡基因bcl2的转基因小鼠皮层神经元,可明显抵抗β 淀粉样蛋白的神经毒性损害,提示以抑制神经元凋亡为目的的AD神经保护基因治疗具有研究潜力。
越来越多的证据说明β淀粉样蛋白(特别是Aβ1-42)在脑内沉积是AD早期的主要病理变化。APP、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)的基因突变引起家族性AD,与Ab1-40和总β淀粉样蛋白相比,Ab1-42相对增加。APP变异的转基因鼠脑内的纤维斑块主要含Aβ1-42,并表现出AD的许多病理学特点。AD患者脑内最初沉积的是Aβ1-42,而不是Aβ1-40。这些都支持淀粉样蛋白沉积理论,因此抗淀粉样蛋白治疗是治疗AD的一种方法。
2.2.1 Secretase Inhibitors分泌酶抑制剂 APP有α和β两种裂解方式,Aβ内的α分泌酶裂解APP生成非淀粉样可溶性β APP和Ｃ端APP片段,另一方面,β分泌酶裂解APP的蛋白水解过程,随后被γ分泌酶裂解,生成Ａｂ片段。γ分泌酶裂解的位置是决定Ａｂ1-42与Ａｂ1-40相对水平的关键因素,Ab1-42开始沉积,神经毒性需要Ab的聚集。抑制β和(或)γ分泌酶能够减少Aβ的产生。现已经成功地克隆出一种β分泌酶BACG/Asp2,它可用来研究这些酶的特异性抑制剂。最近研究还发现presenilins实际上就是γ分泌酶,或是其中的一部分。让带有APP的AD转基因鼠口服γ分泌酶抑制剂能降低鼠脑内Aβ的水平,但用抑制γ分泌酶抑制剂会减少Notch信号的传导,Notch信号传导是各种细胞生长过程中的信号传导方式［11］。
2.2.2 抑制tau蛋白的磷酸化 神经纤维缠结中的双股螺旋状细丝的主要成分就是tau蛋白。Ａβ的纤维诱导tau蛋白磷酸化,使微管失去结合能力,导致树突聚集(45)。Aβ还能增加tau蛋白激酶Ｉ、糖原合成酶3β(TPKI/GSK3b)等几种蛋白激酶的活性,这些酶都能促进tau蛋白的磷酸化。这提示Ａβ纤维形成,通过激活GSK3b导致tau蛋白的非正常磷酸化,破坏微管的稳定,可导致神经元死亡。用GSK3b的反义核苷酸阻断Aβ诱导的神经细胞毒性作用有可能延缓AD的发展。最近合成的非ATP、竞争性、选择性GSK3b抑制剂可避免tau蛋白的过磷酸化,这将是一种治疗AD的新途径［12］。
2.3 老年性痴呆的基因治疗和神经生长因子 AD基因治疗的早期策略是向脑内移植遗传修饰后能够产生NGF的神经细胞系，但由于供体－宿主相容性的问题限制了现有神经细胞的应用。后来有人采用同时脑内移植经遗传修饰后能够产生NGF的3T3成纤维细胞和胚胎胆碱能神经元，结果有效地促进了胆碱能神经元的存活，并利用抗胆碱乙酰基转移酶染色的方法发现胆碱能神经末梢可向产生NGF的细胞方向出芽生长。在NGF的作用下，存活的胆碱能神经元释放乙酰胆碱的能力也有所加强。用原代培养的成纤维细胞做工程细胞也获得了相似的治疗效果，而且发现神经元轴突向富含NGF的移植物中生长的机制与星状胶质细胞往移植物中渗透有关。这些早期的研究留给人们的启示是:可以利用脑内移植经遗传修饰后能够产生神经营养因子的工程细胞的方法达到治疗神经系统变性性疾病及神经修复的目的。除了神经营养因子外，还可以通过神经递质的恢复或替代方法治疗AD。通过向病变区导入乙酰胆碱以补充局部神经递质的不足有可能促进功能的恢复和改善。另一种方法更为简易和使用的方法是通过构建适当的重组基因和表达载体来制备能够穿过血脑屏障的融合蛋白，从而达到从外周非神经组织移植细胞经血液循环向CNS提供具有特殊治疗作用的大分子多肽的目的。Friden等报道将NGF和转铁蛋白受体的抗体相结合，这一复合物不仅可以穿过血脑屏障，而且可以促进移植的胆碱能神经元的存活。 给患者脑内提供外源性神经营养因子的途径很多,但基因治疗AD一直是近几年来研究的重要策略［13］。
基因治疗AD一直是多年来研究的重点课题，但是目前还存在许多的问题，基因合成的神经营养因子价格昂贵，有待于降低成本提高产量以满足临床的需求；转基因治疗给AD患者带来了曙光，在神经营养转基因治疗AD的研究中，对于BDNF和GDNF的研究尚处于起步阶段；而AD患者脑内神经元溃变相当广泛，目前转基因治疗AD的研究主要是针对一个或几个脑区，因此还需要进一步的改进和探索；另外，目的基因表达产物在脑内的表达的量和活性的改变以及基因治疗的方法还不够成熟等等还需进一步的研究和探索［13］。
可以预见，随着人类基因组计划的完成。AD的发病机制的进一步阐明，有效治疗的靶基因的发现导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的改进，基因表达产物在脑内的表达的量和活性的控制技术不断成熟，基因治疗必将成为治疗AD的新的强有力的手段［14］。
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作者单位：1 650031 云南昆明，昆明医学院研究生院
2 650031 云南昆明，昆明医学院
(编辑：秋 实)