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【摘要】 目的 本研究用RT-PCR的方法观察葛根中药血清对成骨细胞细胞因子：OPG、RANKL mRNA表达的影响，力求从细胞水平和分子水平对葛根抗骨质疏松的机制进行探讨，为葛根应用于临床防治骨质疏松提供有力的实验依据。方法 将(250±10)g的SD大鼠36只，随机分为两组：对照组灌服生理盐水，中药组灌服2g/ml的葛根10ml/kg·d，1日2次灌胃，连续3天，最后一次灌胃后中药组和对照组分别1h、2h、4h无菌操作股动脉采血，收集血清备用。出生24h内的SD大鼠，无菌取颅盖骨，做成骨细胞培养。第三代成骨细胞 5×104/ml细胞悬液，24h待细胞贴壁后加入实验因素，6天后用异硫氰酸胍一步法提取总RAN，然后用RT-PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果 最后一次用药后2h采血的中药血清可明显上调成骨细胞OPGmRNA表达，且明显下调成骨细胞RANKL mRNA的表达。随血清添加量的增加，对成骨细胞OPG mRNA表达上调作用越强，对成骨细胞RANKL mRNA的表达无影响。结论 实验表明，葛根可能通过上调成骨细胞OPG mRNA的表达，下调成骨细胞RANKL mRNA的表达，抑制破骨细胞的产生和功能，为葛根防治骨质疏松提供了有力的实验依据。
【关键词】 葛根；成骨细胞；OPG；RANKL
The effect of roots of kudzu vine on the mRNA expression of OPG and RANKL of osteoblasts
WU Nai-zhong,LI Hong-li,CUI Shu-yun.
The Third Central Hospital of Baoding City,Hebei 071051,China
【Abstract】 Objective To explore the effects of roots of kudzu vine on the mRNA expression of OPG and RANKL of osteoblasts using RT-PCR. To provide the experimental base for its preventing and treating the OP in clinic, it is urgent to explore the mechanism of roots of kudzu vine anti-osteoporosis in cell and molecular level.Methods 36 SD rats weighting (250±10)g,are randomly divided into two groups. Control group and herb group were administered orally with physiological salt solution and with epimedium sagittatum maxim（2g/ml）twice a day at 10ml/kg body weight per day, respectively for three days. At the third day the serum was collected from the femoral artery at one hour, two hours and four hours after the last administration of medicine. Primary rat osteoblasts were isolated from newborn mouse calvariae. The third passage osteoblasts were plated at the density of 5×104/ml in 75ml culture flask, twenty four hours later treatment factors were added. Total RAN was extracted from osteoblasts using guanidine, and mRNA expression of OPG and RANKL were examined using RT-PCR.Results Serum of roots of kudzu vine can up-regulate mRNA expression of OPG of osteoblasts and down-regulate mRNA expression of RANKL of osteoblasts.The effect of serum of medicine harvested at 2h after the last medicine administration is the most strong and the effect for OPG was in dose-dependent manner ,however the effect for RANKL was not in dose-dependent manner.Conclusion The experiment showes roots of kudzu vine might inhibit the generate and function of osteoclast by up-regulating the mRNA expression of OPG and down-regulating mRNA expression of RANKL. It has provided the experiment base for roots of kudzu vine preventing and treating the OP in clinic.
【Key words】 roots of kudzu vine;osteoblast;OPG;RANKL
随着老龄化社会的到来，骨质疏松症已成为世界广泛的问题之一。许多激素及细胞因子通过调节破骨细胞和成骨细胞这两类细胞的数量和活性，使骨量维持动态平衡。成骨细胞骨形成功能的减退和/或破骨细胞骨吸收作用的增强可造成代谢性骨病，如骨质疏松。近年来发现的护骨素［1，2］（osteoprotegerin,OPG）、核因子-κB受体活化子配体［3，4］（receptor activator of NF-KappaB ligand ,RANKL）及其相关因子核因子-κＢ受体活化子［5］（receptor activator of NF-KappaB，RANK ）对骨质疏松的发病机制和防治有了新的认识，并且成为骨代谢研究的新的靶点。OPG作为RANKL的诱骗受体阻断其与表达于破骨细胞前体细胞和成熟的破骨细胞表面的功能性受体RANK的作用，从而抑制破骨细胞的分化和功能。OPG和 RANKL基因在成骨细胞均可表达,由成骨细胞分泌的OPG及RANKL在破骨细胞分化、成熟和信号传递过程中起着重要的调节作用。
现代医学证明葛根（roots of kudzu vine）主要的有效成分为异黄酮类，其有雌激素样作用，属于天然的植物雌激素(phytoestrogen,PE)。本研究用RT-PCR的方法观察含葛根中药血清对成骨细胞细胞因子：OPG、 RANKL mRNA表达的影响，力求从细胞水平和分子水平对葛根抗骨质疏松的机制进行探讨，为葛根应用于临床防治骨质疏松提供有力的实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 出生24h内的SD大鼠，(250±10)g SD大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂 葛根（购于保定市第三中心医院），DMEM培养基（GiBco），胰蛋白酶（GiBco），Ⅱ型胶原酶（Sigma）,新生小牛血清（NCF）（北京鼎国生物试剂公司），RT-PCR试剂（北京赛百盛基因技术公司），PCR引物：OPG(gene bank:NM-012870) 北京赛百盛基因技术公司合成，上游引物：5’-CGAGTGATGAATGCGTGTA-3’ 下游引物：5’-TTCTGAAGTAGCAGGAGGC-3’ 扩增产物为301 bp； OPGL(gene bank: NM-057149)北京赛百盛基因技术公司合成，上游引物：5’-CCATCGGGTTCCCATAAAG-3’ 下游引物：5’-TGAAGCAAATGTTGGCGTA-3’ 扩增产物为 142bp；β-actin(gene bank: NM-031144)上海捷倍斯公司合成，上游引物：5’-GAGACCTTCAAGACCCCAGCC-3’ 下游引物：5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA -3’ 扩增产物为404bp。
1.3 主要器械与仪器 CO2培养箱(德国Heraus)，倒置显微镜（重庆光学仪器厂），PCR扩增仪（美国 MJ Research公司产品）。
1.4 方法
1.4.1 成骨细胞培养 出生24h内的SD大鼠，75%乙醇浸泡5min ，无菌取颅盖骨，在D-Hanks液中认真刮去结缔组织，清洗3次后将剪碎的骨片于0.25%胰蛋白酶室温消化15min，0.1%Ⅱ胶原酶室温消化45min，移入 DMEM（含20%小牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素）培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养，3天后换培养基，待细胞80%汇合后用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%NCF的DMEM培养基吹打，制成细胞悬液，计数后传代。
1.4.2 动物分组及给药 中药葛根常规煎熬，加热浓缩终浓度为2g/ml 。SD大鼠32只， 雌雄兼用，随机分为2组： 中药组，生理盐水组(对照组)， 20g/kg·d 1日2次灌胃，连续3天。
1.4.3 含药血清制备 最后一次灌胃后分别1h、2h、3h无菌操作股动脉采血，将大鼠血离心3000r/min 取血清，每组血清混匀，于56℃水浴30min灭活，-20℃保存，用时0.22μm微孔滤膜过滤，用无血清DMEM配成所需浓度。
1.4.4 成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的检测
1.4.4.1 成骨细胞中总RNA的提取 成骨细胞传至第三代，将细胞用0.25%胰蛋白消化，细胞计数后用含10%小牛血清的DMEM培养基制成5×104/ml细胞悬液，接种于75ml培养瓶，37℃ 5%CO2培养箱中培养，24h待细胞贴壁后加入不同时效和量效的中药血清和对照组血清，每组重复4瓶，培养6天后采用异硫氰酸胍一步法提取总RAN，-70℃保存。
1.4.4.2 RNA鉴定和定量 取5μl RNA溶液经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和完整性，紫外灯下观察；另取5μl RNA溶液稀释后于260nm、280nm测定光密度，计算RNA含量及OD260nm/OD280nm 比值以确定其纯度。选OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0间的RNA作RT-PCR。
1.4.4.3 RT-PCR
1.4.4.3.1 cDNA合成 取模板RNA 1.5μg和下游引物15pmol，混匀，70℃孵育5min，放入冰浴中，在反应体系中加入孵育的混合物和上游引物15pmol，补无菌三蒸水至20μl，混匀后短暂离心。放入PCR仪中，42℃60min，94℃5min。
1.4.4.3.2 PCR 94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min。
1.4.4.3.3 PCR产物分析 PCR产物5μl上样于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压为3～5V/cm，电泳缓冲液为0.5×TBE，30min后停止电泳。紫外灯下观察并用数码相机照相，图像用Adobe Photoshop软件去色，转换为TIF格式后用Tatallab v1.10软件分析，得到待测的RNA扩增产物与内参照β-actin RNA扩增产物的光密度值，计算每一样品和其内参照的比值：Asample/Aβ-actin以此作为目的基因RNA的相对表达量。
1.4.5 数据处理 数据采用SAS软件处理，均以x±s表示，两样本均数比较应用方差齐性检验、t检验和t’检验，组间比较用方差分析检验。
2 结果
2.1 不同时间中药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达情况的影响 见表1、表2。
表1 不同时间中药血清对成骨细胞OPG mRNA表达情况的影响（略）
注：vs control★P＜0.01
表2 不同时间中药血清对成骨细胞RANKL mRNA表达情况的影响（略）
注：vs control★P＜0.01
Fig.1 （略）
Fig.2 （略）
Fig.3 （略）
由表1可知大鼠用药后2h 采血的中药血清组，OPG mRNA的相对表达量与对照组比较有明显的统计学差异，P＜0.01；1h和3h采血的中药血清组OPG mRNA的相对表达量与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。由表2可知2h 采血的中药血清组RANKL mRNA的相对表达量与对照组RANKL mRNA的相对表达量比较显著降低，P＜0.01；1h和3h采血的中药血清组RANKL mRNA的相对表达量与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。说明最后一次用药后2h采血的中药血清可明显上调成骨细胞OPGmRNA表达，且明显下调成骨细胞RANKL mRNA的表达。电泳结果见Fig.1，2，3。
2.2 不同浓度中药血清对成骨细胞OPG 、RANKL mRNA表达情况的影响 见表3、表4。由表3可知在培养基中加入2h采血的不同浓度的葛根中药血清， OPG mRNA的相对表达量与对照组OPG mRNA的相对表达量比较有明显的统计学差异，P＜0.01，并且10%与5%、20%与10%组间比较也有明显的统计学差异，P＜ 0.01。说明随血清添加量的增加，对成骨细胞OPG mRNA表达上调作用越强，具有剂量依赖性。5%、10%、20%的血清添加量时，RANKL mRNA的相对表达量与对照组比较有明显的统计学差异，P＜0.01，但10%与5%，20%与5%组间RANKL mRNA的相对表达量无统计学差异（P＞0.05）。说明增加血清添加量对成骨细胞RANKL mRNA的表达无影响。电泳结果见Fig.4，5，6。
Note：lane1 DNA Marker；lane2 control of 1h group;lane3 1h group;lane4 control of 2h group;lane5 2h group;lane6 control of 3h group;lane7 3h group
表3 不同浓度中药血清对成骨细胞OPG mRNA表达情况的影响（略）
注：5% vs control,10% vs 5% and 20% vs 10%★P＜0.01
表4 不同浓度中药血清对成骨细胞RANKL mRNA表达情况的影响（略）
注：5% vs control★P＜0.01,10% vs 5% and 20% vs 5%▲P＞0.05
Fig.4 （略）
Fig.5 （略）
Fig.6 （略）
Note：lane1 DNA Marker;lane2 control group;lane3 5% serum of medicine dosage group;lane4 10% serum of medicine dosage group;lane5 20% serum of medicine dosage group
3 讨论
骨质疏松是常见的老年性疾病，多见于绝经后妇女，即绝经后骨质疏松，其以骨高转化为特征。遗传、雌激素、营养和生活方式与骨质疏松发病密切相关，主要还是因体内雌激素缺乏导致骨吸收大于骨形成，从而骨组织骨量进行性丢失，造成骨质有机物和无机物成比例地减少。但具体发病机制尚未阐明［6］，多年来雌激素替代疗法是目前防治本病的常用方法，而长期应用雌激素易出现乳腺痛、易怒、钠水储留，撤药后子宫出血等副作用，甚至增加子宫内膜癌及乳腺癌的危险［7］。所以研究开发新的、安全有效的防治绝经后骨质疏松的药物具有重要的临床意义。
骨重建过程主要由成骨细胞和破骨细胞共同参与，已经证实破骨细胞来源于骨髓中与单核巨噬细胞克隆形成单位（GM-CFU）不同的骨髓造血干细胞系，而成骨细胞来源于骨膜下发生于基质细胞的骨原细胞（osteogenic cell），这两种细胞起源的的显著差异和潜在的密切联系一直为人们所关注。以往研究发现，影响破骨细胞分化及功能的多种钙调激素和局部因子，如甲状旁腺激素（parathyrion hormone,PTH）、前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）、IL-11、1,25(OH)2D3等都不是直接作用于破骨细胞，而是首先作用于成骨细胞，再间接调控破骨细胞的形成和功能［8］。随着OPG 、RANKL、RANK这些细胞因子的发现，对成骨细胞调控破骨细胞的形成及功能的分子机制有了深入的认识。OPG 、RANKL是成骨细胞正常的分泌分子，二者通过调节破骨细胞的生成、活化和凋亡而发挥调节骨代谢的作用。通过同源重组获得的OPG无活性(OPG-/-)小鼠，证明OPG可阻断破骨细胞形成和骨吸收。OPG(-/-)小鼠早期即引发骨质疏松症，伴随破骨细胞的增加，骨强度和骨密度下降，骨折发生率增加，成年OPG(-/-)小鼠表现出一系列的脊椎压迫性骨折和股骨垢破坏［9］。Simonet等在过度表达OPG的转基因鼠肝脏检测此蛋白的生物活性，且血中出现高水平的OPG，此鼠表现出严重的股骨和脊椎的骨质硬化，并且破骨细胞数量的显著减少，但并不伴随巨噬细胞的减少。后来发现OPG能与RANKL结合，许多促吸收因子和激素作用于OPG以调节破骨细胞的生成和功能。RANKL具有多种生理作用，但对骨代谢的主要作用是刺激破骨细胞的分化，增强成熟破骨细胞的活性并且抑制其凋亡，从而导致骨吸收和骨丢失的增加。RANKL与破骨细胞及破骨细胞前体细胞上的功能性受体RANK结合， RANK 通过信号转导作用于破骨细胞，促进破骨细胞的分化、融合、活化和生存并抑制其凋亡［10］。RANKL 是破骨细胞前体细胞分化的特异的，必需的因子。OPG有2个已知的TNF家族的配体，RANKL和TNF相关诱导凋亡配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）。OPG作为RANKL的诱骗受体竞争性抑制RANKL的作用，从而抑制破骨细胞的形成和功能，OPG为骨吸收的负性调节因子。由此可见骨质疏松的发病与OPG 、RANKL有着密切的联系。葛根素为葛根有效成分之一异黄酮类的主要有效成分，有研究报道葛根素具有减少骨吸收，促骨形成，增加骨密度的作用［11］，而在刺激子宫组织增生副作用方面又远较雌激素为轻，但葛根对破骨细胞是否产生作用及作用的机制尚未阐明。
通过本实验表明葛根中药血清，可提高成骨细胞OPGmRNA的相对表达量。大鼠最后一次用药后2h采血的中药血清作用最强，与对照组比较有统计学差异；5%、10%及20%的中药血清添加量作用依次增强，说明有剂量依赖性。同时对成骨细胞RANKL mRNA的表达进行观察，发现葛根中药血清对其有抑制作用，且大鼠最后一次用药后2h采血的血清作用最强，而5%、10%及20%的中药血清添加量各组间作用无显著性差异，说明无剂量依赖性。由此可见葛根可能通过上调OPG的表达和下调RANKL的表达减少破骨细胞的生成，抑制破骨细胞的活化，从而降低破骨细胞的骨吸收功能。有研究报道雌激素可与成骨细胞膜上的α-雌激素受体结合上调OPG的表达，尽管葛根的主要化学成分为黄酮类化合物，但至于葛根对OPG与RANKL的表达的调节是否以激素的方式发挥作用，及其具体调节的机制有待于进一步研究证实。
以上实验结果表明，葛根中药血清可上调OPG的表达，下调RANKL的表达，这很可能是整体水平葛根抑制破骨细胞的生成和活化，从而发挥抗骨质疏松的分子基础。我国是葛根药用植物的分布中心，资源优势明显，因而在开发利用葛根来防治骨质疏松，尤其是绝经后骨质疏松大有作为。本实验在细胞水平和分子水平，为葛根用于骨质疏松，尤其是绝经后骨质疏松的防治提供了有力的理论依据，具有重要的临床价值。
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(编辑：秋 实)
作者单位： 071051 河北保定，保定市第三中心医院