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【摘要】 [目的]观察金属Co2+、Cr3+离子对小鼠成骨细胞(MC3T3E1)的细胞毒性以及在Co2+、Cr3+离子刺激下对成骨细胞分泌RANKL、OPG的影响。[方法]体外培养成骨细胞。MTT法检测细胞活力。ELISA法对培养上清液RANKL、OPG浓度进行检测。[结果]MTT显示与对照组相比，钴铬离子使成骨细胞的细胞活力明显下降。成骨细胞暴露在钴铬离子下，与对照组相比，24 h、48 h后：OPG的分泌分别增长32.1%、17.8%(P<0.05);RANKL的分泌量分别是对照组的61.6倍、13.8倍(P<0.05);RANKL/OPG比率分别升高51.4倍、12.3倍。[结论]金属离子对成骨细胞有细胞毒性，可刺激成骨细胞释放RANKL、OPG，并上调RANKL/OPG的比值。
【关键词】 钴离子; 铬离子; 成骨细胞; 骨保护素; 骨保护素配体
Effects of cobalt and chromium ions on osteoblasts: cytotoxicity and the releasion of RANKL and OPG∥DAI Min,YUAN Xiao-jun,CHEN Xi-gao,et al. Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nan Chang 330006, China
Abstract: To investigate the cytotoxicity of cobalt(Co2+) and chromium (Cr3+)ions on mice osteoblast(MC3T3E1)and the effects on the secretion of RANKL/OPG from osteoblast because of the stimulation of Co2+ and Cr3+ ions. The osteoblast in vitri was cultured.The cell viability was assured by MTT test. ELISA method was applied to detect RANKL (receptor activator of nuclear factor-kB ligand) ,OPG(osteoprotegerin) content in serum supernatant.Compared to the control,MTT test demonstrated that Co2+ and Cr3+ ions can obviously decrease the cell viability of osteoblast. When osteoblast were exposed to Co2+ and Cr3+ ions for 24 and 48 hours,the releasion of OPG increased by 32.1% and 17.8% as compared with the control (P<0.05);the RANKL were 61.6 -fold, 13.8-fold growth (P<0.05) ; and the ratios of RANKL/OPG proteins were upregulated by 51.4 - fold and 12.3-fold.Co2+ and Cr3+ ions have a cytotoxic effect on osteoblasts and stimulate the releasion of RANKL and OPG from osteoblast, upregulate the the ratios of RANKL/OPG proteins.
Key words：cobalt ion; chromium ion; osteoblast; OPG; RANKL
关节置换术在临床应用越来越普遍，由于金属-金属假体所表现的良好稳定性及耐磨性，使得金属-金属假体重新引起了骨科界重视。但与其他假体配伍一样，假体在使用过程中也会产生大量的磨损颗粒和金属离子，其中离子以金属假体含量较高的钴铬离子为主，导致假体周围骨溶解，引起假体无菌性松动，其原因主要分为机械因素与生物学因素。就生物学因素来说，主要为假体在使用过程中产生磨损颗粒引起溶骨性因子分泌的增加，最终导致破骨细胞的活化与扩增，促进骨溶解的发生。研究发现，成骨细胞可分泌一些细胞因子如RANKL(receptor activator of nuclear factor-kB ligand)、OPG(osteoprotegerin)、M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)等，调节破骨细胞的分化与成熟。关于金属离子对无菌性松动作用的相关研究较少，本文主要通过体外试验来探讨小鼠成骨细胞暴露在金属钴、铬离子下对无菌性松动的影响。
1 材料与方法
1.1 CoCl2与CrCl3溶液的制备 用环氧乙烷消毒的CoCl2与CrCl3粉末溶解于无菌注射用水，配成CoCl2与CrCl3溶液。胎牛血清购于杭州四季青。小鼠成骨细胞MC3T3E1由南昌大学医学院药理研究所惠赠。
1.2 成骨细胞培养 小鼠成骨细胞常规培养于含10%胎牛血清的a-MEM培养基的培养瓶中，放入培养条件为37℃、5%的CO2孵箱中。每3 d换液1次，当瓶壁细胞丰度达80%左右后用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
1.3 金属离子对成骨细胞的干预试验 待成骨细胞生长24 h贴壁后，对细胞进行换液。实验组给予含有的Co2+、Cr3+培养基，其终浓度根据Fleury等[1]的研究分别为10 ppm和150 ppm。对照组则加入不含有金属离子的培养基。
1.4 MTT比色试验 96孔板接种细胞，每孔6 000个，每组6孔，加入MTT液(5 mg/ml)20 μl/孔，37℃孵育4 h，吸去孔内液体，加入DMSO液体150 μl/孔，振荡10 min，用酶标仪选择490 nm波长测定各孔吸光值，其值与细胞数量成正比。
1.5 ELISA法检测上清液RANKL与OPG蛋白含量 分别培养24 h和48 h后收集上清液，按小鼠RANKL与OPG ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.6 统计学分析 所有数据用均数±标准差，用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。组间比较用随机设计的两样本均数比较，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT比色试验
结果见表1，与对照组相比，给以离子干扰后，细胞MTT实验的OD值明显下降，24 h、48 h、72 h分别下降22%、25%、45%，有统计学意义(P<0.05)。表1 各组MTT(OD值)测定结果
2.2 Co2+、Cr3+对成骨细胞分泌OPG的影响
下图显示与对照组相比，Co2+、Cr3+与成骨细胞相互作用24 h后，其OPG的分泌增长32.1%(P<0.05);48 h后，OPG的分泌增长17.8%(P<0.05)。
2.3 Co2+、Cr3+对成骨细胞分泌RANKL的影响
在无离子干扰下，24 h成骨细胞分泌RANKL量极少，48 h时明显升高，是24 h的5.9倍;与对照组相比，Co2+、Cr3+与成骨细胞相互作用24 h、48 h后RANKL的分泌量分别是对照组的61.6倍、13.8倍(P<0.05)。
2.4 Co2+、Cr3++对成骨细胞RANKL/OPG比率的影响
Co2+、Cr3+与成骨细胞共培养24 h、48 h后与对照组相比，RANKL/OPG比率分别升高51.4倍、12.3倍。 图1对照组、离子组细胞培养24 h、48 h后分别收集上清液，检测OPG分泌量 图2对照组、离子组细胞培养24 h、48 h，分别收集上清液，检测RANKL分泌量 图3对照组、离子组细胞培养24 h、48 h RANKL/OPG比值3 讨论
无菌性松动是全髋关节置换术后最主要的中远期并发症，严重影响了假体的使用寿命，其机制主要包括机械因素与生物学因素，最终导致破骨细胞性骨吸收大于成骨细胞性骨形成，从而引起假体与骨的整合障碍。多数学者认为，RANKL/OPG/RANK通路在无菌性松动中起重要作用[2、3]。RANKL、OPG主要由成骨细胞、成纤维细胞等合成，RANKL有两种亚型：膜型(mRANKL)与分泌型(SRANKL)，分泌型为起主要作用的亚型，可直接与破骨细胞表面的受体RANK结合，通过激活NF-KB、C-JUN等一系列胞内信号通路，最终促进破骨细胞的分化与成熟;OPG为RANKL的诱骗受体，阻止其与RANK结合，从而抑制破骨细胞的分化与成熟，减少骨的吸收。成骨细胞还分泌I-胶原，其为骨有机质最主要的成份，为骨的钙化提供广阔的载体。
Savarino L等研究发现[4、5]，无论是采用金属-聚乙烯假体还是金属对金属，抑或是陶瓷-陶瓷假体，在使用过程中，机体均会因腐蚀等各种原因产生大量的金属离子，以钴铬离子为主。体外实验证实[6]，钴铬离子可刺激单核巨噬细胞(破骨细胞前体细胞)释放大量的TNF-a，从而引发一系列骨吸收性因子的级联放大效应，促进骨吸收。但金属离子对成骨细胞的生物学效应的研究较少。
本实验研究表明，钴铬离子对成骨细胞具有细胞毒性，这与Fleury C等[1]的研究结果一致。细胞毒性下的成骨细胞，其活力下降，从而其I-胶原的表达下降，骨形成减少。此外本研究还发现，成骨细胞在无离子刺激下，RANKL的分泌量很少;给予钴铬离子干预后，RANKL的分泌明显增加，且随时间延长而增加，但RANKL比OPG的增加更显著，使得RANKL/OPG的比值明显增加。与Donatella G等[7]研究结果相比，钴铬离子比超高分子聚乙烯、陶瓷颗粒有更强的刺激RANKL、OPG分泌的功能。Hofbauer LC等[8]研究发现，破骨细胞的分化与成熟主要是由RANKL、OPG的比值来决定的。因此，作者认为钴铬离子可显著促进破骨细胞的骨吸收。
综上所述，可得出结论：金属钴铬离子对成骨细胞具有细胞毒性，并可刺激成骨细胞释放RANKL、OPG，并促进RANKL/OPG比值的增加，从而降低成骨细胞的活力，促进破骨细胞的分化与成熟，导致成骨细胞性骨形成能力下降和破骨细胞性骨吸收能力的增加，引起假体的无菌性松动。本实验不足在于未对RANKL、OPG进行基因水平的检测。有待于进一步研究。
【参考文献】
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作者单位：(南昌大学第一附属医院骨二科，江西南昌 330006)