剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立

     ［摘要］   目的   建立护骨素（OPG）基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型，为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础。方法   PCR方法扩增两条同源臂，将两条用于同源重组的片段插入XpPNT载体，构建OPG基因敲除打靶载体。线性化及纯化以后通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞，并用G418和Gancyclovir进行双药筛选培养，得到双药抗性克隆后抽提基因组DNA，采用PCR和southern杂交方法确定同源重组的胚胎干细胞克隆。 结果   经双药筛选得到124个双药抗性克隆，PCR和southern杂交鉴定获得一个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论   总之，本研究成功获得了OPG（-/+）杂合子小鼠胚胎干细胞克隆，为进一步通过显微注射及交配育种获得OPG基因剔除小鼠，在活体水平研究OPG基因的功能打下基础，同时也使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能。

    ［关键词］   基因敲除；胚胎干细胞；护骨素；骨质疏松

       Establishing the heterozygous model of OPG gene knockout ES cell

    QIAO Jianou,ZHOU Longnv,NING Guang,et al.The 9th Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200232,China

    ［Abstract］   Objective   To obtain the homologous recombinant embryonic stem cell （ES cell ）with their OPG gene knocked out. Methods   A targeting vector pointing to OPG exon 2 and a little part of intron 2 was built with 3.3kb Xbal/BamHI fragment as short arm and 3.9kb NotI/SalI fragment as long arm after two homology arms was got by PCR.The linearized and purified targeting vector DNA was transfected into ES cells through electroporation and then some of these ES cell lines survived G418 and Gancyclovir selection.Twodrugresistant clones were expanded and identified by PCR and Southern blot. Results   Totally 124 twodrugresistant clones were harvested and one of them was confirmed as positive. Conclusion   The result of this experiment made basis for the further establishment of the OPG knockout mouse model and the deeper study of OPG in vivo.

    ［Key words］   knockout;ES cell;osteoprotegerin;osteoporosis

    骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病，也是影响人类健康的常见病。如何建立一个特异的动物模型是相关领域的一个热点。护骨素（osteoprotegerin,OPG）是近年来发现的具有抑制破骨细胞分化及吸收活性的一种分泌型糖蛋白［1］，属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）超家族。研究表明，OPG在骨质疏松症、风湿性关节炎、Paget病以及恶性骨组织疾病（骨肉瘤，巨细胞瘤，转移性癌）等的发病机制、预防和治疗中具有重要作用。本研究利用分子克隆方法，设计并构建针对小鼠OPG基因第2外显子大部分以及部分第2内含子的打靶载体，采用基因打靶的技术手段，剔除小鼠ES细胞OPG基因,为进一步通过显微注射制备OPG基因剔除小鼠模型奠定基础。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料   载体质粒pBluescriptⅠⅠ(+/-)和XpPNT质粒由上海南方模式生物中心提供，PCR产物克隆载体pGEMTeasy为Promega公司产品。各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、随机引物法DNA标记试剂盒,各种Taq酶、PCR相关试剂及RTPCR试剂盒等购自Takara及NEB公司。DNAmarker（100bp ladder，1kb ladder，Lamda－HindIII fragment）购自NEB和Takara公司。蛋白酶K购自上海生工生物工程技术服务公司。Trizol购自GibcoBRL和Invitrogen公司。质粒小量抽提试剂盒购自华舜生物工程公司和上海生工。质粒中抽试剂盒及凝胶回收试剂盒（Quick gel extraction Kit）购自Qiagen公司。杂交液ExpressHyb hybrization solution购自Clontech公司。常规化学试剂主要购自Sigma和中国医药集团上海化学试剂公司。放射性同位素［α-32P］-dCTP、［α-32P］-dATP为Amersham公司产品。细胞培养相关试剂:包括DMEM液体培养基（high glucose,Lglutamine,no sodium pyravate,EScellqualified）、非必需氨基酸、谷氨酰胺、无Ca2+/Mg2+的PBS、含Ca2+/Mg2+的PBS、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、胎牛血清（EScellqualified）、G418，Gancyclovir（GANC）、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素/链霉素、胰蛋白酶(trypsin/EDTA)、胶原（Gelatin）等试剂均为GibcoBRL、Sigma公司产品,LIF(ESGROTM)为CHEMICON（Australia）公司产品。细胞培养用35 mm、100 mm细胞培养皿，24孔、48孔和96孔细胞培养板,离心管等耗材为Corning产品。引物合成和测序：由上海申友生物技术公司完成。引物序列用DNAstar软件包根据序列资料自行设计。ES细胞株：体外传至第13代的小鼠，CJ7细胞系（来自Sv129小鼠）由上海第二医科大学基础医学院医学遗传教研室保存。

    1.2   实验方法

    1.2.1   打靶载体的构建

    1.2.1.1   提取ES细胞基因组DNA   收获状态良好的ES细胞，加适量裂解液及蛋白酶K，56 ℃过夜；次日将样本于室温12000 rpm离心10 min；取上清液，无水乙醇沉淀，冰预冷70%乙醇洗涤；晾干后，适量纯水溶解，4 ℃保存备用。

    1.2.1.2   PCR方法获得两条同源臂   以小鼠的OPG基因cDNA序列在Genebank中比对（BLAST），获得小鼠OPG基因序列。根据NCBI GenBank提供的序列，用DNAstar软件的Primerselect确定上、下游两条同源臂的两对引物，上游同源臂的上游引物：CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT(对应OPG基因14842-14861bp) ；下游引物:TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA（对应OPG基因18152-18171bp）；PCR条件：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;60 ℃，50 s;72 ℃，3.5 min。35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。上游同源臂长3331 bp。下游同源臂的上游引物：ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT(对应OPG基因18580~18598bp)下游引物：GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA(对应OPG基因22478~22497bp)；PCR条件为：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;61.5 ℃，50 s;72 ℃，4 min.35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。下游同源臂长3918 bp。     

    1.2.1.3   将DNA片段正确克隆于XpPNT载体   将两条同源臂的PCR产物回收并连接至PCR产物克隆载体pGEMTeasy，大肠杆菌转化扩增后测序鉴定。常规法将下游同源臂以NotI/SalI导入载体XPpnT,再将上游同源臂以Xbal/BamHI插入已经含有上游同源臂的XPpnT载体。酶切鉴定及序列测定表明，连接顺序正确，将此打靶载体命名为5-3opg-XpPNT,以NotI酶切线性化，回收，-20 ℃保存备用。

    1.2.2   ES细胞基因打靶

    1.2.2.1   ES细胞电穿孔基因转移   取密度约1.2×107/ml的ES单细胞悬液0.8 ml，加入含Ca2+和Mg2+的PBS0.1 ml(含约30 μg经NotI线性化的5-3opgXpPNT)，混匀后移入无菌电穿孔杯中。常温条件下，以240 V，500 μF的电参数进行单脉冲击发后，重新悬浮于ES培养基,取细胞悬液平均接种到2个胶原化的35 mm平皿中,使用非选择性培养基复苏24 h后进行药物筛选。

    1.2.2.2   药物筛选抗性细胞   在细胞电穿孔基因转移后24 h开始进行药物选择。其中1个30 mm的平皿使用含有选择药物G418(终浓度为400 g/ml)和Gancyclovir（终浓度为2 mmol/L）的培养液进行选择性细胞培养，另1个平皿仍然使用非选择性培养基培养作为对照。经7~8天筛选，ES细胞克隆长成肉眼可见的细胞集落，即可进行挑取。14天共挑取药物抗性细胞克隆124个。

    1.2.3   阳性ES细胞克隆的鉴定

    1.2.3.1   抗性ES细胞基因组DNA的提取   从长有ES细胞的48孔板中吸去培养液，PBS洗1次，每孔加入500 μl细胞裂解液［含4 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA（pH 8.0），5％Sarkosyl，0.1 mmol/LTris HCl，0.2 mmol/L NaCl，1 mg/ml蛋白酶K］,55 ℃过夜,加入1 ml无水乙醇,轻摇混匀，-80 ℃静止放置30 min,13000 rpm离心10 min，小心吸去上清，用70%乙醇洗涤晾干，溶于100 μl纯水备用。

    1.2.3.2   PCR鉴定同源重组克隆   上游同源臂方向设计引物5-acccaccatcttcactcacttctg-3位于上游同源臂外侧；5-gcatcgccttctatcgccttcttg-3位于neo基因5端，反应条件为:95℃，5 min；94 ℃ 50 s;60 ℃ 50 s；72 ℃ 4 min。35 cycles：72 ℃ 10 min。发生同源重组的ES克隆DNA应特异扩增出5.0 kb条带。下游同源臂方向设计引物5-ggaaaaactcaacccccatactca-3位于下游同源臂外侧基因组上；5-gctaccggtggatgtggaat-3位于neo基因3端，反应条件为:95 ℃，5 min；94 ℃ 50 s;61 ℃ 50 s;72 ℃ 5.5 min。35 cycles：72 ℃ 10 min。发生同源重组的ES克隆DNA应特异扩增出6.5 kb条带。

    1.2.3.3   Southern杂交鉴定阳性克隆   用EcoRV消化30 ml ES克隆基因组DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳，0.2 mol/L盐酸脱嘌呤及变性液碱变性后原位将DNA转至尼龙膜上，紫外交联后4 ℃保存。杂交用探针以PCR方法扩增获得，所用两条引物序列如下：5-CAGAAAACTCAACCCCCATACTCA-3,5-GGAAAACACCGGCCCTACTACATA-3。PCR条件：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s;57 ℃ 45 s;72 ℃ 45 s。31cycles：72 ℃ 10 min。探针长度454 bp,用NEB公司生产的随机引物法标记试剂盒进行标记，预杂交和杂交按ExpressHyb hybrid solution的使用说明中所介绍的方法进行。洗膜后压片，置于-80 ℃冰箱中进行放射自显影。发生同源重组的ES细胞DNA应出现10.6 k带，而野生型的DNA出现16.7 k带。

    2   结果

    2.1   同源臂的PCR与测序   PCR获得与预期大小一致且特异性好的产物。二条同源臂的长度分别为3331 bp和3918 bp，见图1。测序结果显示上下游同源臂分别测出515 bp和528 bp，BLAST分析各有一碱基突变。

    2.2   打靶载体的鉴定   打靶载体示意图见图2。打靶载体5-3opgXpPNT经NotI和SalI双酶切后得到3.3 kb和11.6 kb两个片段；经HindIII酶切后得到4.2 kb、4.6 kb和6.1 kb三个片段，与预期的结果相符见图3，同时对两条同源臂和载体的接头处进行了测序，结果显示连接的方向完全正确（结果略）。

    2.3   阳性ES细胞克隆的鉴定   ES细胞护骨素基因剔除及阳性ES细胞克隆的鉴定策略见图4。第一次打靶共获得抗性克隆124个，其中113号为正确同源重组克隆，野生型ES细胞DNA经EcoRV酶切并杂交后得到16.7 kb条带，剔除了OPG 基因exon2的大部分及部分intron2碱基的阳性ES细胞经EcoRV酶切并杂交后得到10.6 kb条带和16.7 kb条带（见图5）。另外阳性ES细胞经PCR扩增分别得到4.5 kb和6.5 kb的特异性条带（见图6）。

    3   讨论

    OPG是Simonet等于1997年在测序胎鼠小肠cDNA文库时发现的、具有401个氨基酸的分泌型碱性糖蛋白。OPG多肽链含有一段信号肽和7个结构域，其中4个富含半胱氨酸（Cys）的结构域D1~D4是OPG与配体结合的部位，而D5~D62是2个死亡结构域。在破骨细胞分化的微环境中OPG由成骨/基质细胞分泌，作为诱饵受体（decoy receptor）与NF-КB受体活化因子配体（receptor activator of NF-КB ligand,RANKL）发生竞争性结合，抑制RANKL与RANK的相互作用，从而调控破骨细胞的分化、增殖、凋亡，并且影响其生理功能［2］。OPG水平降低或者RANKL/OPG比值升高导致破骨细胞活性增加，促进破骨细胞的分化成熟。例如在风湿性关节炎中，发生骨损部位的局部RANKL/OPG比值升高［3，4］，而重组OPG可以完全抑制骨损部位破骨细胞的吸收活性［5］。相反，在骨肉瘤中OPG水平很高，RANKL/OPG比值降低［6，7］，破骨细胞的活性受到抑制使得成骨细胞异常的快速增殖。在人体，OPG基因多态性与骨质疏松性骨折相关［8］，血清中OPG水平与具有生物活性的雌激素和睾酮呈负相关关系［9］。随着年龄增长，血清中OPG水平上升，尤其是绝经后骨质疏松患者血中OPG增高显著，这可能是对骨吸收亢进的机体代偿。绝经后妇女皮下注射重组OPG后，骨吸收生化指标下降［10］。OPG用于治疗癌性骨痛也有一定效果［11,12］。正是由于OPG的重要作用，使其成为目前的一个研究热点。而基因剔除技术的发展，使得我们能够在活体水平从反面更好地研究OPG基因的功能。

    对人和小鼠的基因组比较发现，基因编码部分比较保守，差异主要在内含子和重复序列等非编码区域［13］。OPG基因结构也基本符合这一规律,小鼠OPG基因同样含有5个外显子，二者间除5号外显子外，相应外显子大小基本一致,而内含子则相对保守性较差。尽管OPG mRNA具有不同的剪切形式，某些剪切形式可能含有部分或全部内含子，但外显子基本一致。其中2号外显子包括编码信号肽的大部分序列和编码D1~D3结构域的序列，后者被认为是OPG与配体结合的部位；如2号外显子被剔除，则OPG基因的功能完全消失。据此，本研究以载体XpPNT为骨架构建了针对小鼠OPG基因2号外显子（以及一小部分2号内含子）的打靶载体。其同源臂位于2号外显子的两侧（见图3），长度分别为3.3 kb和3.9 kb。打靶载体线性化和纯化后通过电穿孔转导ES细胞，经G418和Gancyclovir选择性富集后挑取双药抗性克隆124个，经PCR和southern杂交对双药抗性克隆进行鉴定成功获得同源重组克隆一个。将同源重组的ES细胞通过显微注射方法导入C57BL/6小鼠囊胚，然后植入假孕小鼠子宫，最后得到了12只嵌合比例在90％以上的嵌合体雄性小鼠。将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠杂交，对产生的后代中毛色为灰色的小鼠进行基因型分析。PCR和southern杂交证实在30只灰色小鼠中有15只是剔除了OPG基因的杂合子小鼠，符合孟德尔遗传定律。

    打靶载体有两种基本类型，即置换型打靶载体和插入型打靶载体。在已有的基因剔除研究中，采用的大多是置换型打靶载体。本研究也使采用置换型打靶载体。在打靶载体构建中，一般采用一长一短2条同源臂。短臂长0.5~2 kb,利于用PCR方法对ES克隆进行筛选，长臂一般较长，难以用PCR鉴定克隆,同源臂总长度约5~10 k。在载体构建中，根据已经公布的小鼠基因组序列，用PCR产物作为同源臂，两臂分别为3.3 k和3.9 k，短臂和长臂的同源重组事件都可用PCR鉴定，从而增加了可靠性。但是扩增的上下游的2条PCR目的片段的长度仍然有5.0 k和6.5 k。我们采用了梯度PCR，热启动，并使用高GC含量专用Buffer，效果很好。

    目前已有文献表明OPG基因敲除致OPG缺乏小鼠（纯合子）在出生后出现进行性加重的骨质疏松和动脉钙化［1，14］，而人类原发性骨质疏松症也常伴发动脉钙化，其中钙盐以羟基磷灰石形式沉着，并表达多种骨基质蛋白，类似骨形成，与OPG(-/-)小鼠的表型非常相似，因此后者可以考虑作为骨质疏松症研究和抗骨质疏松药物研发筛选的动物模型。目前用于骨质疏松症研究的动物模型主要有去卵巢（VOX）大鼠模型，老年性骨质疏松动物模型，制动模型，皮质醇致骨质疏松模型和维甲酸致骨质疏松模型等。但是在长期的动物实验和临床观察中发现，动物模型试验结果与临床观察结果常不一致。因此应该建立特异性高、靶位专一的动物模型。通过基因打靶方法建立剔除了OPG基因的胚胎干细胞，为进一步通过显微注射获得OPG基因剔除小鼠，在活体水平研究OPG基因的功能打下基础，同时也使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能。

    ［参考文献］

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    14   Bucay N,Sarosi I,Dunstan CR,et al.Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.Genes Dev,1998,12(9):1260-1268.

   作者单位： 1 200232 上海，上海交通大学第九人民医院急诊科（△通讯作者）

    2 上海，上海交通大学瑞金医院内分泌科

    3 上海，上海交通大学医学院医学遗传学教研室

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