点击显示 收起
【摘要】 目的 建立肿瘤Ⅰ号胶囊中芦荟大黄素、大黄素与大黄酚的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为 Kromasil ODS-1（4.6 mm×200 mm, 5μm），以甲醇-0.1%磷酸（75 : 25）为流动相，流速为1.0ml/min，柱温35℃，检测波长为254nm。结果 芦荟大黄素在1.38～22.1μg/ml浓度范围内，大黄素在1.31～21.0μg/ml浓度范围内，大黄酚在 2.20～35.2μg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数均为0.9999。方法平均回收率分别为98.1%（RSD=1.2%），98.6%（RSD=0.99%）和97.4%（RSD=1.4 %）。结论 方法简便，准确，重现性好，可作为肿瘤Ⅰ号胶囊质量控制方法之一。
【关键词】 肿瘤Ⅰ号胶囊；芦荟大黄素；大黄素；大黄酚；hplc
Simultaneous determination of Aloe-emodin,Emodin and Chrysophanol in ZhongliuⅠcapsule by HPLC
JIN Yi, ZHANG Yue-hui, LIU Xing-chao,et al.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016, China
【Abstract】 Objective To develop a HPLC method for simultaneous determination of Aloe-emodin、Emodin and Chrysophanol in ZhongliuⅠcapsule.Methods The analysis was used with a Kromasil ODS-1(4.6mm×200mm,5μm) column and a mobile phase of methanol -0.1% phosphoric acid solution（75：25）.The flow rate was 1.0ml/min and column temperature was 35 ℃. The detection wavelength was set at 254nm.Results The calibration curve was linear within the range of 1.38～22.1μg/ml for Aloe-emodin,1.31～21.0μg/ml for emodin and 2.20～35.2μg/ml (r=0.9999) for Chrysophanol, the average recoveries were 98.1%（RSD=1.2%）for Aloe-emodin, 98.6%（RSD=0.99%）for Emodin and 97.4%（RSD=1.4%） for Chrysophanol.Conclusion This method was convenient, accurate and reproducible for determination of Aloe-emodin, Emodin and Chrysophanol in ZhongliuⅠcapsule.
【Key words】 ZhongliuⅠcapsule; aloe-emodin; emodin; chrysophenol;HPLC
肿瘤Ⅰ号胶囊由莪术、丹参、大黄、淫羊藿等十余味药材提取加工制成，临床上治疗乳腺各类癌瘤、乳腺增生、乳腺炎均获得满意效果。有研究表明,大黄抗癌作用的主要成分为游离蒽醌衍生物和糖类。蒽醌类衍生物可通过抑制肿瘤细胞的呼吸和物质代谢，抑制DNA、RNA的生物合成达到抗癌作用［1］。本研究以大黄中芦荟大黄素、大黄素和大黄酚为检测指标成分，建立了肿瘤Ⅰ号胶囊中芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的同时含量测定方法，结果表明该方法简便快速，分离度好，结果准确可靠。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10AT型高效液相色谱仪，SPD-10A型紫外检测器；KQ-50B型超声仪。芦荟大黄素对照品、大黄素对照品和大黄酚对照品购于中国药品生物制品检定所，甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil ODS-1（4.6mm×200mm，5μm），流动相甲醇︰0.1%磷酸（75∶25；v/v），柱温35℃，流速1.0ml/min，检测波长254nm，进样量20μl。在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按芦荟大黄素峰计算不低于2500，按大黄素峰计算不低于3000，按大黄酚计算不低于4000。芦荟大黄素、大黄素和大黄酚峰与相邻色谱峰的分离度均＞1.5。阴性对照对样品测定无干扰，色谱图见图1。
图1 HPLC色谱图 略
2.2 线性关系试验 分别取芦荟大黄素、大黄素和大黄酚对照品适量，精密称定，置50ml量瓶中，分别用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.092μg/ml、0.088μg/ml和0.088μg/ml的对照品储备液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。依次精密量取对照品储备液Ⅰ，Ⅱ 0.15, 0.3, 0.6, 1.2和2.4ml；Ⅲ0.25，0.5，1.0，2.0和4.0分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的混合对照品溶液。分别取上述溶液各20μl按上述色谱条件进样分析。以对照品浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程分别为
芦荟大黄素： Y=0.079×104X+6.584×102（r=0.9999，n=5）大黄素：Y=4.788×104X+5.661×103（r=0.9999，n=5）大黄酚：Y=6.748×104X+5.258×102（r=0.9999，n=5）结果表明，芦荟大黄素在1.38～22.1μg/ml浓度范围内，大黄素在1.32～21.2μg/ml浓度范围内，大黄酚在2.20～35.2μg/ml的范围内，Y与X之间具有良好的线性关系。
2.3 对照品溶液制备 精密量取上述对照品储备液Ⅰ0.6ml，Ⅱ0.6ml，Ⅲ1.0ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含芦荟大黄素5.52μg，含大黄素5.25μg，含大黄酚8.80μg）。
2.4 供试品溶液制备 取样品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，回流提取30min，放冷，滤过，回收溶剂，残渣加15ml 8%盐酸溶液溶解，再加20ml氯仿加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，分取氯仿层，酸液继续用氯仿提取3次，每次20ml，合并氯仿层，回收溶剂，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后取续滤液作为供试品溶液。
2.5 阴性对照溶液制备 按处方比例称取除大黄以外的其余药味，按2.4项下“供试品溶液制备”操作，制成阴性对照溶液。吸取20μl进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰干扰。结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰。
2.6 色谱系统精密度试验 取同一对照品溶液，在相同的色谱条件下连续进样6次，计算芦荟大黄素、大黄素和大黄酚色谱峰面积的RSD分别为0.69%、0.82%和1.1%（n=6）。
2.7 方法重复性试验 取同一批号样品粉末5份，按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备5份样品，在上述色谱条件下进行分析测定，芦荟大黄素含量的相对标准偏差RSD为1.1% (n=5)；大黄素含量的相对标准偏差RSD为2.0% (n=5) ，大黄酚含量的相对标准偏差RSD为1.4%(n=5)。
2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下静置，分别于0，2，4，8，12，24h按上述色谱条件测定，测得芦荟大黄素、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为1.1%、2.6%和1.1%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
2.9 回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的供试品9份，按低、中、高浓度分别精密加入芦荟大黄素、大黄素、大黄酚对照品储备液，每一浓度3份，按上述色谱条件测定。分析结果见表1。
表1 回收率试验结果 (略)
2.10 样品测定 取3批样品，每批取3份，按2.5项下的方法制得供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的含量。结果见表2。
表2 含量测定结果 （略）
3 讨论
3.1 色谱条件的选择 为同时测定芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的含量，参考相关文献［2,3］，试用甲醇－0.5％冰醋酸，乙腈－0.1 %磷酸，甲醇－0.1 %磷酸等流动系统，经过试验，以甲醇-0.1%磷酸为流动相，芦荟大黄素、大黄素和大黄酚与其他组分均能达到基线分离。
3.2 检测波长的选择 分别测定芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的紫外光谱，结果表明，三种成分均在254nm附近有最大吸收，故选择254nm作为测定波长。
3.3 提取方法的选择 大黄含有游离型和结合型蒽醌成分，含量测定是检测游离型蒽醌成分总含量，故采用水解同时提取的方法。经考察，甲醇回流提取时间在0.5、1.0、1.5h范围内结果无明显差异，故提取时间为0.5h。选择乙醚、氯仿作为提取溶剂进行考察，结果表明氯仿优于乙醚，且操作相对简单。
本复方制剂药味多，测定含量时干扰较大。采用本法测定，具有简便，重复性好，且稳定的特点，可作为肿瘤Ⅰ号胶囊质量控制方法之一。
【参考文献】
1 姜晓峰,甄永苏.大黄逆转肿瘤细胞多药抗药性作用.药学学报,1999,34(3):164-164.
2 刘东平.HPLC法测定大败毒胶囊中大黄素和大黄酚的含量.现代中药研究与实践,2005,19(3):35-37.
3 卢文彪,曾元儿.大承气汤颗粒剂质量控制研究.湖南中医药导报，2002,8(4):148-151.
作者单位： 1 110016 辽宁沈阳， 沈阳药科大学药学院
2 110015 辽宁沈阳，沈阳市药品快速检验所
(编辑：悦 铭)