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原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居全球之首，而且还有上升趋势。全世界每年约有25万人死于肝癌，我国就有12万人之多，其中以江苏启东和广西扶绥的发病率最高。由于起病隐袭，恶性程度高，手术切除率低，预后极差，大多数肝癌患者在确诊时已达中晚期，失去了手术时机。因此，肝癌的临床研究应具有“早期、积极、综合”的特点，其中综合治疗是目前治疗中晚期肝癌的基本原则。在位瘤苗局部注射联合开腹直视冷冻治疗可能成为综合治疗中晚期肝癌的重要手段之一。
1 在位瘤苗局部注射治疗肿瘤的研究进展
生物治疗是一种以现代分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等前沿科学为基础的新式治疗方法，近年来许多蛋白质、多肽、载体疫苗和微载体疫苗已进入临床前期或临床研究阶段。在美国已经进入到Ⅱ期临床。最新的研究显示其对非小细胞肺癌、肾癌的治疗效果比较理想。R.Midgley［1］等报道了采用肝癌细胞系HepG2的提取物刺激DC用于肝细胞癌的治疗，取得一定的疗效，且安全低毒，患者容易耐受。根据瘤苗的来源不同，肿瘤疫苗可分为活疫苗、灭活疫苗、修饰或改变的瘤细胞及亚细胞成分疫苗四种。根据瘤苗作用的对象不同，又可分为特异性肿瘤疫苗和通用肿瘤疫苗。各种类型的肿瘤疫苗均有其自身的优势与局限。目前在基础和临床上研究得较多的是基因转染的腺病毒载体疫苗及IL-4和GM-CSF共同刺激外周血产生DC（CLK）方法。前者的技术原理是将GM-CSF的基因与腺病毒载体融合后转染到肿瘤细胞内，使之在肿瘤细胞内产生GM-CSF来刺激机体免疫系统识别肿瘤细胞。后者的原理实际上就是通过体外细胞因子与免疫细胞共育，以使这些细胞活化，然后再回输入患者体内，进行过继免疫细胞疗法。这些方法都已运用于临床多年，取得了较大的进展。根据美国FDA批准的临床试验的生物治疗药物的种类，主要在四个方面有较大的突破：(1)树突状细胞瘤苗，目前已进入临床试验阶段；(2)分子靶向治疗药物的成功应用,其中最引人注目的是Herceptin(贺赛汀)、Rituximab(美罗华)、Glivec(格列卫)和ZD1839(Iressa)等;(3)采用核素标记单克隆抗体的放射免疫治疗也有了较大的进展,尤其是在治疗NHL方面取得了令人瞩目的疗效；(4)生物化疗模式的推广应用。下面着重谈谈树突状细胞瘤苗的研究进展。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是人体内最有效的抗原提呈细胞，近年来，DC已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的热点之一，越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫,特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫反应，在机体抵御恶性肿瘤和传染性疾病中发挥着十分重要的作用，而且最近DC疫苗的临床Ⅰ、Ⅱ期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在恶性肿瘤治疗中的巨大前景。
1.1 肿瘤抗原多肽或蛋白直接刺激DC 从外周血培养获得DC，采用的肿瘤抗原多肽或蛋白直接刺激DC，诱导产生CTL用于恶性肿瘤的治疗。有多项此类研究已进入临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验。这些研究主要集中在有比较明确的肿瘤抗原表位的恶性肿瘤，如恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等。P.Schellhammer［2］等报道了采用APC8015（前列腺磷酸酯酶）与细胞因子的融合蛋白刺激DC用于对前列腺癌患者的Ⅲ期临床试验，所选患者均为内分泌治疗无效的，初步结果显示此种疗法安全有效，且毒副作用小，患者容易耐受。但由于我们对特异的肿瘤抗原知之甚少,故有一定的局限性。
1.2 采用肿瘤组织蛋白提取物刺激DC 为了解决特异肿瘤抗原获得困难的问题，有学者采用超声破碎和反复冻融等方法制备肿瘤细胞蛋白提取物刺激DC，诱导产生特异性CTL，有多项此类研究已进入临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验。R.Midgley［1］等报道了采用肝癌细胞系HepG2的提取物刺激DC，用于肝细胞癌的治疗，取得一定的疗效，且安全低毒，患者容易耐受。J.W.C.Chang［3］等也报道了采用恶性黑色素瘤细胞提取物刺激DC对Ⅳ期恶性黑色素瘤患者的治疗，结果亦显示安全可靠，能诱发特异的免疫反应。但采用此种方法制备DC，由于提取物中有可能含有机体自身抗原，故有可能诱发自身免疫性疾病。且由于要求提供的肿瘤组织较多，故在临床应用中有一定的难度。
1.3 抗原及细胞因子基因转染DC 采用肿瘤抗原多肽或蛋白及肿瘤组织蛋白提取物刺激DC，由于采用的抗原及细胞因子均有一定的半衰期，因此往往需要多次重复刺激，才能诱发较强的CTL。故有不少研究采用抗原基因转染DC或细胞因子基因转染DC，使抗原分子及细胞因子在DC内长期稳定表达，因而具有较好的刺激效果。目前用于转染基因的病毒载体常用的有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，这三种病毒载体中，腺相关病毒是目前最有希望用于人类基因治疗的病毒载体，Liu Yong，Paul.L.Hermonat和罗荣城［4,5］等采用腺相关病毒为载体，将人乳头状病毒的E6和E7及GM-CSF等基因转染DC用于宫颈癌患者的治疗，初步结果显示此种疗法安全有效。同时，将BA-46基因或突变型Her-2/Neu基因及转染DC用于乳腺癌的治疗，实验结果显示能诱导针对特异抗原的CTL［6］，进一步的临床试验正在进行中。美国研究人员曾对43例肺癌患者进行了为期3个月的瘤苗注射试验,并连续3年对这些患者进行跟踪观察测试,结果发现其中3例病情比较严重的患者已经康复,其他处于癌症中期的患者的病情基本趋于稳定,个别患者的癌细胞停止扩散长达2年之久。生物治疗的飞速发展已经给广大肿瘤患者带来了巨大福音。
2 肝癌冷冻治疗的研究进展
冷冻治疗肝癌的基本原理是在-40℃以下的低温使癌细胞产生不可逆性凝固性坏死。20世纪70年代已应用于临床并取得一定的疗效，80年代末、90年代初，由于深部冷冻技术的进步，使冷冻治疗中晚期肝癌取得了突破性进展，疗效有很大提高，成为治疗中晚期肝癌综合治疗的重要方法之一。表现在二个方面：(1)对大肝癌及不能切除肝癌，优于手术切除；(2)对小肝癌的冷冻治疗，其1、3、5年生存率并不低于手术切除［7］。其作用机理是-15℃以下时因渗透作用引起细胞脱水，细胞内骤然发生冻结，造成细胞器损伤和溶质浓度改变及酸中毒，同时使血管痉挛、栓塞、毛细血管渗透压增加、血流缓慢、动静脉短路开放、血流减少，几天后即发生冷冻坏死。有报道［8］肝缺血时冷冻一次相当于无缺血时冷冻2～3次，解冻时间前者延长60%。动物实验表明冷冻后肝组织汇管区类上皮细胞及嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润［9］，还可能产生肿瘤特异移植免疫以及抑制再植肿瘤生长。Bayjoo等实验［10］显示NK细胞的细胞毒性在冷冻后增强。肝癌冷冻技术进展较快，20世纪80年代的浅表冷冻技术致冷广度和深度均受到极大限制，对较大的癌块还不能将其全部置入冷冻区内，到90年代深部冷冻技术已用于临床，开腹直视冷冻治疗肝癌技术已成为综合治疗的一种重要方法。肝癌冷冻治疗的装置，目前也有了较大的改进，国内多使用LCS-2000型机进行肝癌冷冻治疗［11～14］，冷冻后多数病例AFP下降，CT表明肿瘤缩小，但因时间短，生存率仅见1～2年的报道。开腹直视冷冻技术适应证：(1)合并肝硬化较严重，不能耐受手术切除者；(2)不能切除的巨块型肝癌；(3)复发性肝癌因余肝较小，切除后肝功能可能失代偿者；(4)主瘤切除后，余肝或切缘有残癌者。同时病人必须具备剖腹探查条件。其禁忌证：(1)肝功能严重损害，有腹水或恶病质及远处转移者；(2)严重器质性病变，肾功能不全者；(3)多结节及弥漫性肝癌，癌块超过半肝者。
冷冻治疗作为不可手术肝癌的一种治疗手段，具有安全、出血少、冻后组织反应轻、可产生免疫反应、可减少手术切除引起癌播散、冷冻后患者恢复快、生活质量较高等优点。
3 在位瘤苗局部注射联合开腹直视冷冻治疗中晚期肝癌的临床展望
在位瘤苗局部注射联合开腹直视冷冻治疗中晚期肝癌是生物治疗和冷冻治疗联合应用于肝癌治疗的一种全新综合治疗方法，为中晚期肝癌的治疗开创了一条新的途径。其方法选择具有冷冻适应证的患者结合肝CT或B超等影像学检查，开腹直视肝肿瘤的大小、范围，测算所需在位瘤苗剂量进行多位点把瘤苗种植到肝癌组织中，再使用冷冻治疗，将这两种方法有机地结合起来，在位瘤苗及细胞因子均为FDA和SDA所允许的产品（见图1）。
图1 （略）
选择患者，开腹直视确定肝癌细胞冷冻范围及剂量。用在位瘤苗结合至冷冻后的肿瘤细胞膜上。TNFα、GM-CSF结合至在位瘤苗上。开腹直视冷冻技术治疗中晚期肝癌已收到了一定的效果。我们采用联合在位瘤苗局部注射的方法可以提高冷冻后机体对肝癌细胞的主动免疫功能。从理论上讲，采用在位瘤苗局部注射后有两个优势：一是能使局部吞噬清除能力加快。肝癌细胞周围布满激活巨噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DC）及多种细胞的细胞因子，并且此种细胞因子是固定在肝癌细胞上，达到相当长一段时间内能刺激机体免疫功能的目的；二是能增强体内抗原提呈细胞（APC）对肝癌细胞膜的抗原提呈能力，也就是提高机体免疫系统对肝癌细胞的杀伤能力。这种作用是全身性的，这对经局部冷冻术后残留的肝癌细胞或者已转移的肝癌细胞能达到一定程度的清除作用，真正做到了治疗肝癌（原发病灶）、清除残留或转移的肝癌细胞、预防肝癌复发的作用。在位瘤苗局部注射后再结合冷冻治疗，可使肝癌细胞发生坏死、不分裂、不增殖、逐渐被体内巨噬细胞（Mφ）、中性粒细胞所吞噬，清除。肝组织汇管区类上皮细胞及嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润，还可能产生肿瘤特异移植免疫以及抑制再植肿瘤生长，NK细胞的细胞毒性增强等，又进一步加强和提高了机体的主动免疫能力。
以上两种方法联合应用治疗中晚期肝癌的根据是立足于各自(在位瘤苗或冷冻)单用时的有效性和合用时的更有效性,即“强强联合”的原则。最大限度的发挥抗肿瘤作用,且最小的毒副作用。在位瘤苗局部注射联合开腹直视冷冻治疗，能提高中晚期肝癌患者的生存率，改善生活质量，使肿瘤缩小或消失，清除残留或转移的肿瘤细胞，对全身免疫功能有促进作用，减少肿瘤复发，从而达到最佳的治疗效果。这种生物冷冻治疗肝癌的新思维和新模式,是现代肿瘤综合治疗的一种新方法,具有良好的社会效益和经济效益。
【参考文献】
1 R Midgley, D J Kerr, N Mirza, et al. A phase Ⅱdendritic cell (DC) immunotherapy trial for hepatocellular carcinoma (HC). Proceedings of ASCO, Volume 21 2002, 23b, 1901.
2 P Schellhammer, E J Small, C S Higano, et al. Augologous dendritc cells pulsed with prostatic acid phosphatase (APC8015) for hormone refractory prostate cancer: a phsae Ⅲ randomized, double blind, placebo controlled trial. Proceedings of ASCO， Volume 21 2002, 183a, 731.
3 J. W. C. Chang, J. J. Hsieh, J, S. Chen, et al. Immunotherapy with dendritic cells pulsed by autologous dactinomycin-theated melanoma apoptotic cells for patients with malignant melanoma. Proceedings of ASCO， Volume 21 2002, 3b, 1820.
4 Yong Liu, Maurizio Chiriva-Internati, Paul L. Hermonat, et al. Rapid induction of cytotoxic T-cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene dilivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector. Cancer Gene Therapy, 2001， 8(21): 948-957.
5 Maurizio Chiriva-Internati, Yong Liu, Paul L. Hermonat, et al. Efficient generation of cytotoxic T lymphocytes against cervical cancer cells by adeno-associated virus/human papillomavirus type 16 E7 antigen gene transduction into dendritic cells. Eur J Immunol, 2002, 32: 30-38.
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12 王少斌，芮静安，迟天毅．原发性肝癌的深部冷冻治疗．中华普通外科杂志，1997，12（5）：285-286.
13 郑树林，王伟林，梁庭波，等．肝癌冷冻治疗86例报告．中华肝胆外科杂志，1998，4（1）：40-41.
14 周信达，汤钊猷，余业勤，等．肝癌多模式治疗远期疗效．中华外科杂志，1996,34(9):518-521.
(编辑：秋 实)
作者单位： 530023 广西南宁，南宁市第四人民医院