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【摘要】 目的 制备汉防己甲素脂质体并进行性状观察研究。方法 采用逆相蒸发法制备汉防己甲素脂质体，检测脂质体稳定性、药物包封率和不同存放时间药物渗漏率，电镜观察脂质体形态、大小。结果 汉防己甲素脂质体（膜脂浓度35mg/ml）稳定性良好，药物包封率可达72.9%，药物脂质体4℃存放1、3、6个月时药物渗漏率分别为2.51%、4.52%、8.11%。电镜下观察，脂质体呈圆球形，大小较均匀，粒径大小为（264±47）nm。结论 采用逆相蒸发法成功制备了汉防己甲素脂质体，其具有良好的稳定性和较高的药物包封率。
【关键词】 汉防己甲素；脂质体；制备；性状
Preparation and study of the morphosis and properties of liposome-tetrandrine
GUO Zi-lin,WANG Xue-chun,MA Yu-ling,et al.Jining Medical College,Jining 272013,China
【Abstract】 Objective To prepare liposome-tetrandrine and study the morphosis and properties of liposome-tetrandrine.Methods The liposome-tetrandrine was prepared by reverse-phase evaporation vesicle method.The stability,drug encapsulation efficiency and leakage ratio in different storage period of liposome-tetrandrine were tested,and the morphosis and size of liposome were observed by an electron microscope.Results The liposome-tetrandrine (membrane lipid content:35mg/ml) had a strong stability,and the drug encapsulation efficiency was 72.9% in liposome-tetrandrine.The drug leakage ratio of liposome-tetrandrine reserved in the condition of 4℃ for one month,three months and six months was 2.51%,4.52% and 8.11% respectively.The liposomes had a little ball shape,and the particle size of liposomes was 264±47nm.Conclusion The liposome-tetrandrine was successfully prepared by reverse-phase evaporation vesicle method,it had a strong stability and higher drug encapsulation efficiency.
【Key words】 tetrandrine;liposome;preparation;properties morphosis
汉防己甲素为钙离子通道阻滞剂,可影响钙离子的跨膜转运及在细胞内的分布和利用，具有消炎、镇痛、降压、抗矽肺等作用，近年来研究发现，汉防己甲素具有抗肝纤维化作用，其作用机制主要是抑制参与肝纤维化形成的主要细胞—贮脂细胞（fat-storing cell，又称Ito cell、hepatic stellate cell、lipocyte）的增殖、转化和细胞外基质的合成分泌［1～5］。汉防己甲素按常规制剂方式用药后，药物广泛分布于各组织，无明显组织靶向性，难以将药物集中于病变肝组织而发挥更强的治疗作用，并会产生较明显的药物副作用，如低血压等心血管副作用。如能用具有肝靶向作用的脂质体包封汉防己甲素，可靶向作用于肝组织，提高肝组织药物浓度，加强药物的抗肝纤维化作用，并可降低或消除药物的副作用，产生更好的抗肝纤维化治疗效果。为此本研究首先利用卵磷脂和胆固醇为膜脂材料，采用逆相蒸发法（reverse-phase evaporation vesicle method,REV)［6］制备汉防己甲素药物包封脂质体，并对脂质体稳定性、形态、大小、药物包封率和不同存放时间药物渗漏率进行了观察研究。为汉防己甲素脂质体抗肝纤维化的动物实验和临床应用研究提供依据，从而为抗肝纤维化的药物治疗寻求新途径。
1 材料与方法
1.1 实验材料 汉防己甲素（杭州中香化学有限公司），卵磷脂（华东师范大学化工厂），胆固醇（北京化学试剂公司），Sephadex-G50 (Pharmacia 公司）。RE-2AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏有限公司），C0250型水浴超声清洗仪（上海超声波仪器厂），UV-754紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），JEM-1200EX透射电子显微镜（日本）。
1.2 汉防己甲素脂质体的制备 汉防己甲素不溶于水，可溶于稀盐酸，精确称取50mg汉防己甲素，加入9ml蒸馏水，滴加1N盐酸0.2ml，使之溶解，作为水相。根据脂质体膜脂（卵磷脂、胆固醇）终末浓度分别为25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml的含量，分别精确称取卵磷脂和胆固醇（卵磷脂：胆固醇=4：1），溶于适量乙醚中，作为有机相。将水相和有机相溶液混合（水相溶液：有机相溶液=1：3～1：6），水浴超声5min，间歇2min，共2次，形成均匀的油包水（W/O）乳液，于旋转蒸发仪上40℃水浴减压旋转蒸发乙醚，至凝胶形成，涡旋振荡使凝胶转相，水浴超声2min，继续减压旋转蒸发，除尽乙醚，形成乳白色脂质体乳液，水浴超声2min，使脂质体粒径均匀，逐滴滴加1mol/L的磷酸氢二钠溶液，调pH至6.5，加少量蒸馏水定容到10ml，100℃灭菌30min，4℃存放。汉防己甲素脂质体膜脂（卵磷脂、胆固醇）含量分别为25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml，汉防己甲素药物含量5mg/ml。然后以脂质体稳定性和药物包封率（Encapsulation efficiency,EN%）为观察指标，筛选出汉防己甲素脂质体制备的最佳方案。
1.3 汉防己甲素脂质体稳定性观察 采用以下三种实验观察汉防己甲素脂质体的稳定性：（1）将制备的脂质体进行离心实验，3000r/min，离心20min，观察是否有分层、沉淀。（2）100℃灭菌30min，观察脂质体是否能保持均匀乳液状态，有无膜脂凝集块、絮状聚集物及沉淀物。（3）4℃存放24h、1周、1个月、3个月、6个月，观察脂质体是否有分层、沉淀和絮状聚集物。
1.4 汉防己甲素脂质体药物包封率测定 采用Sephadex-G50分子凝胶层析法分离脂质体和未包封的游离药物，测定游离药物含量，按照下列公式计算脂质体的药物包封率：
包封率EN%=（1-W游/W总）×100%
式中W游和W总分别表示未包封的游离药物量和层析时上样脂质体药物总量。
取Sephadex-G50 3g，加空白层析洗脱液100ml（空白层析洗脱液采用如下方法配制：取蒸馏水90ml，加入1N盐酸2ml，用1mol/L磷酸氢二钠溶液，调pH至6.5，加少量蒸馏水定容到100ml）。室温溶胀6h，装柱前煮沸以除去其中空气，装层析柱（1cm×40cm），用空白层析洗脱液平衡层析柱。汉防己甲素脂质体层析上样量为0.2ml，加入空白层析洗脱液，洗脱流速1ml/min，逐管收集洗脱流份，用紫外分光光度法［7］在282nm波长（汉防己甲素吸收峰）下测定各流份吸光度，洗脱过程中流出组分顺序依次为洗脱液、脂质体流份（乳白色液体）、洗脱液、游离汉防己甲素流份、洗脱液。将游离汉防己甲素流份合并，以空白层析洗脱液定容后测定。汉防己甲素标准液配制：汉防己甲素10mg，加入90ml蒸馏水，滴加1N盐酸2ml，使汉防己甲素溶解，用1mol/L磷酸氢二钠溶液，调pH至6.5，加少量蒸馏水定容到100ml，汉防己甲素浓度为100μg/ml，取此标准液用空白层析洗脱液配制各浓度标准液，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml，以空白层析洗脱液为空白管，在282nm波长下测定各标准液吸光度，绘制汉防己甲素标准曲线，同时测定游离汉防己甲素流份（合并定容后）吸光度，查标准曲线，计算游离汉防己甲素含量，按包封率计算公式计算汉防己甲素脂质体的药物包封率。
1.5 汉防己甲素脂质体药物渗漏率测定 以Sephadex-G50分子凝胶层析法分别测定汉防己甲素脂质体4℃存放1个月、3个月、6个月时的药物包封率，按下列公式计算各存放时间的药物渗漏率。
渗漏率=（EN原包-EN贮包）/EN原包×100%
式中EN原包和EN贮包分别表示初制备时脂质体药物包封率和不同存放时间的脂质体药物包封率。
1.6 汉防己甲素脂质体形态电镜观察 将汉防己甲素脂质体乳液稀释40倍，滴在带有支持膜的铜网上，使脂质体沉积在支持膜上，用滤纸吸取铜网边缘液体，以2%磷钨酸负染1min，滤纸吸取多余的磷钨酸，晾干，于JEM-1200EX透射电镜下观察并拍照（放大4万倍），测量脂质体粒径。由于电镜观察时脂质体被压扁，测量粒径乘以0.707校正系数为实际粒径大小。
2 结果
2.1 汉防己甲素脂质体的稳定性 将5种膜脂浓度下制备的汉防己甲素脂质体做稳定性实验，膜脂浓度为45mg/ml的汉防己甲素脂质体，在3000r/min离心20min后出现较明显的分层和沉淀，100℃灭菌30min，出现淡黄色膜脂凝块并有沉淀物，4℃放置1周，有较明显的沉淀，并有少许絮状聚集物；膜脂浓度为40mg/ml的汉防己甲素脂质体，离心实验后出现少许沉淀，100℃灭菌30min，出现少许膜脂絮状聚集物，4℃放置1个月，有少量沉淀；膜脂浓度分别为35mg/ml、30mg/ml、25mg/ml的汉防己甲素脂质体均具良好的稳定性，3000r/min离心20min，脂质体仍保持均匀乳液状态，无分层、沉淀，100℃灭菌30min，脂质体无膜脂凝集块、絮状聚集物及沉淀物，4℃存放，脂质体存放1个月仍保持均匀乳液状态，存放3个月，瓶底部出现少量沉淀，振摇均可分散，存放6个月时，沉淀物略有增加，振摇仍可分散为均匀乳液状态，脂质体不同存放时间均无分层、絮状聚集物。
2.2 汉防己甲素脂质体药物包封率 分别测定三种稳定性良好的汉防己甲素脂质体三个批次的样品，计算药物包封率，结果见表1。表1 三种脂质体药物包封率测定结果由结果可见，膜脂浓度为35mg/ml的汉防己甲素脂质体药物包封率最高，结合脂质体稳定性，选用之为汉防己甲素脂质体最佳制备方案。
2.3 汉防己甲素脂质体药物渗漏率 汉防己甲素脂质体（膜脂浓度为35mg/ml）的三个批次样品4℃存放1、3、6个月时药物平均渗漏率分别为2.51%、4.52%、8.11%。
2.4 汉防己甲素脂质体形态大小 汉防己甲素脂质体为乳白色均匀乳浊液，电镜下观察，脂质体均呈圆球形，为单层脂质体，大小较均匀，粒径大小为（264±47）nm。
3 讨论
脂质体是由脂质双分子层构成的微球囊泡。脂质体的主要膜脂成分为磷脂和胆固醇，其分子内均有亲水和疏水基因，通过适当的方法可使磷脂和胆固醇分散于水溶液中，形成双分子层生物膜样结构并构成球形囊泡，可将药物包封于囊泡中形成药物包封脂质体。脂质体制备有多种方法，如薄膜法、逆相蒸发法、注入法、熔融法、冻融法、pH梯度法、复乳法等［6，8］，各种制备方法脂质体药物包封率常有较大差异，本实验根据包封药物的性质、特点采用可获得较高药物包封率的逆相蒸发法制备脂质体，并根据包封的药物进行适当的改进。脂质体制备受多种因素影响，其中包封药物的性质、膜脂浓度是影响脂质体稳定性和包封率的重要因素，本实验选择不同的膜脂浓度，经过一系列实验筛选出稳定性好、包封率较高的制备方案。在选定的5种膜脂浓度下，膜脂为40mg/ml、45mg/ml的汉防己甲素脂质体均不能取得良好的稳定性，而膜脂浓度为25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml的汉防己甲素脂质体均具良好的稳定性，而药物包封率以膜脂35mg/ml的脂质体为最高，故选用之为最佳制备方案。
汉防己甲素又称汉防己碱、粉防己碱，是从防己科植物粉防己（Stephania tetrandra S.Moore)的块根中提取的双苄基异喹啉生物碱。由于其不溶于水，又不同于脂溶性药物可与膜脂融合，但可溶于稀盐酸溶液中，故先将汉防己甲素溶于稀盐酸溶液，制备脂质体后，用磷酸氢二钠调pH至6.5在pH逐步上调过程中，可造成脂质体内外pH梯度，促使部分汉防己甲素进入脂质体，提高药物包封率，此实际上又结合使用了pH梯度法，汉防己甲素脂质体药物包封率平均可达72.9%。
脂质体在存放过程中可发生不同程度的药物渗漏，汉防己甲素脂质体随着存放时间的延长，药物渗漏率逐渐升高，1个月时为2.51%，3个月时为4.52%，6个月时仍在10%以下，说明在4℃存放条件下脂质体包封药物的稳定性较好。如在脂质体制备过程中加入冻干赋形剂，采用冻干技术将制备的脂质体冻干（使用时加水水合重新形成脂质体乳液），可长期存放而又能避免药物渗漏问题，亦便于药物储运，此是进一步研究的内容。
脂质体根据膜脂成分、粒径大小、结构性能可分为不同的类型，依脂质体膜层可分为单层脂质体、多层脂质体；依脂质体膜脂成分及性能可分为常规脂质体、热敏脂质体、pH敏脂质体、阳离子脂质体、多糖修饰脂质体等；单层脂质体依据粒径大小又可分为小单层脂质体（<100nm）、中等大小单层脂质体（100～1000nm）和大单层脂质体（>1000nm）［8，9］。以磷脂、胆固醇为主要膜脂成分的常规中等大小单层脂质体进入血液后，主要通过吞噬、膜融合等方式被网状内皮系统细胞摄取，使药物主要分布在肝、脾等网状内皮细胞较丰富的组织、器官中，对这些组织器官表现出天然的靶向性［8，9］，本研究制备的脂质体即属此种类型脂质体。汉防己甲素脂质体的膜脂成分是卵磷脂和胆固醇，两者均是细胞的固有组分，无毒副作用和免疫原性。经进一步实验研究后，汉防己甲素脂质体可望成为临床抗肝纤维化治疗效果良好而又安全可靠的新型肝靶向药物。
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*基金项目:山东省教育厅资助课题(编号:J00K65)
作者单位： 272013 山东济宁,济宁医学院
(编辑：宋 冰)