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【摘要】 目的 建立一种可信度、敏感度高，适合于微量组织羟脯氨酸含量的测定方法―胃酶酸解法。方法 在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对胃酶法和传统盐酸水解法进行了比较。结果 在相同条件下，传统方法测得HYP含量为0.045～1.547μg/ml，平均值为0.7789μg/ml；胃酶酸解法测得羟脯氨酸含量为2.955～4.500μg/ml，平均值为3.921μg/ml，两者比较差异有显著性（P＜0.01）。结论 胃酶酸解法的可信度、敏感度均优于传统方法，其更适合于微量组织羟脯氨酸的测定。
【关键词】 羟脯氨酸;胃酶酸解法
Establishment of a new and grading-up assay method of HYP in hepatic tissue
XIU He-Ming，GUO Zheng-Rong，XU Zheng.Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082, China
【Abstract】 Objective To establish a assay method of hydroxyproline suited for microcomponent with high degree of confidence and sensitiveness.Methods The two methods of gastric enzyme method and traditional acidification method are compared under the same condition of tissue， weight， oxidize time， coloration temperature， salinity in the sample and para-diaminobenzaidehyde（PDAB）.Results At the same condition，the content of HYP measured by traditional method is between 0.045～1.547μg/ml，the mean value is 0.7789μg/ml；the content of HYP measured by gastric enzyme method is between 2.955～4.500μg/ml，the mean value is 3.921μg/ml. The results was statistically significant difference（P＜0.01）.Conclusion The gastric enzyme method is better than the traditional method in degree of confidence and sensitiveness，and it is more suited for microcomponent.
【Key words】 hydroxyproline;gastric enzyme acidification method
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成分之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，被认为是胶原中的特征性氨基酸。因此，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标，寻求一种合理、优化的HYP含量的测定方法已成为众多学者关注的焦点。目前，人们多使用传统的盐酸水解法测定HYP的含量，由于传统方法对组织要求量比较大，水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。近年来许多的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究，同时也深入的探讨了不同测定方法。虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进，但对其测定方法的研究欠缺，仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究，对传统方法的缺点进行了改进，在标本重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对两种方法进行了比较，探索出一条更为先进、稳定可靠的HYP含量检测方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
1.1.1 羟脯氨酸标准品 北京鼎国生物技术发展中心（进口分装）。
1.1.2 胃蛋白酶 北京中杉生物技术有限公司 （进口分装）。
1.1.3 氯胺－T 天津市光复精细化工研究所。
1.1.4 对二氨基苯甲醛（PDAB） 天津市博迪化工有限公司。
1.1.5 酶标仪 美国VERSAmax。
1.1.6 微量电子天平 瑞士METTLer AE260。
1.2 试剂配制
1.2.1 标准HYP储存液（1mg/ml） 称取100mg HYP标准品，用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100ml，置棕色瓶于4℃保存。
1.2.2 标准HYP应用液（25μg/ml） 取标准HYP储存液（1mg/ml）2.5ml，双蒸水定容至100ml，4℃保存，可用2～3周。
1.2.3 0.1mol/L柠檬酸缓冲液pH 6.0 0.3g柠檬酸和3.25g柠檬酸钠加双蒸水溶解并定容至100ml。
1.2.4 0.05mol/L氯胺－T溶液 1.41g氯胺－T用少量甲醇溶解并定容至100ml。
1.2.5 10％对二氨基苯甲醛（PDAB） 10g PDAB用少量甲醇溶解并定容至100ml。
1.2.6 3.15mol/L高氯酸溶液 70％高氯酸27ml加双蒸水至100ml。
1.2.7 40％NaOH溶液 40gNaOH双蒸水溶解并定容至100ml。
1.2.8 0.5％胃蛋白酶溶液 0.5g胃蛋白酶加少量0.2mol/L盐酸溶解并定容至100ml。
1.3 组织样品 本实验组织样品为肝硬化大鼠肝组织（Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供），肝硬化模型用0.03％硫代乙酰胺（TAA）喂饲5个月制备［1］，经病理检查证实为肝硬化后，用25％硫苯妥钠腹腔麻醉后开腹摘取肝右叶，－80℃保存备用。
1.4 方法
1.4.1 标准曲线的制备 （1）500μl去离子水作为空白对照，然后500μl标准羟脯氨酸溶液（25μg/ml）做倍比稀释，浓度依次为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml。（2）依次加入0.1mol/L的柠檬酸缓冲液pH 6.0和0.05mol/L氯胺－T溶液，37℃水浴氧化25min。（3）3.15mol/L高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5min终止氧化。（4）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3min（显色）。（5）冰浴冷却，各管取200μl分别加入酶标板，空白调零，酶标仪测定A560nm。
1.4.2 传统方法肝组织羟脯氨酸的测定 （1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。（2）加入3ml 6mol/L盐酸，混匀，移入15ml的试管，120℃高压水解2h。（3）40％的NaOH调pH值到6.0，12000rpm离心15min。（4）取500μl上清加入一新准备的15ml试管中，依次加入0.1mol/L的柠檬酸缓冲液和0.05mol/L氯胺－T溶液，37℃水浴氧化25min。（5）3.15mol/L高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5min终止氧化。（6）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3min（显色）。（7）冰浴冷却，各管取200μl分别加入酶标板，空白调零，和准备的标准品一起测定A560nm。
1.4.3 胃酶酸解法肝组织羟脯氨酸的测定 （1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。（2）加入3ml 0.5％胃蛋白酶溶液，混匀，移入15ml的试管，37℃保温24h，每隔3～5h混匀1次，使其充分水解。（3）加入1ml 6mol/L盐酸，120℃高压水解2h。（4）以下步骤同传统方法(3)～(7)。
2 结果
2.1 组织匀浆 传统盐酸水解方法在组织匀浆静置1h后液体出现分离状，沉淀较多；而胃酶酸解法静置后仍呈混悬状态，几乎看不到沉淀。由此可见，胃酶酸解法能够充分水解组织中的胶原，比传统方法水解更加彻底。
2.2 标准曲线 标准曲线如图1 所示。在0～25μg/ml浓度范围内，随着羟脯氨酸含量的增加，A560nm值也增加，即羟脯氨酸含量和所测得的A560nm 值之间呈正向线性关系(r=0.998)。图1 羟脯氨酸标准曲线图2.3 从标本测定结果来看 在条件相同情况下，传统方法测得HYP含量范围为0.045～1.547μg/ml，平均值为0.7789μg/ml；胃酶酸解法测得HYP含量范围为2.955～4.500μg/ml，平均值为3.921μg/ml；是传统方法的5倍，说明此法比传统方法更加敏感，可信度较高。两者比较差异有显著性（t=19.127，P＜0.01)，具体结果见表1。
3 讨论
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）为非必需氨基酸，构成胶原组织主要成分，含量相对稳定，约占胶原氨基酸总量的13％，是衡量组织胶原含量的特异性指标之一，目前可用于HYP含量的测定方法及改良法的报道很多［2～6］，缺点是组织需要量大、耗时较长，所以仍需进一步改进。
影响组织胶原测定的主要因素，在试剂、方法学一定的情况下，胶原的水解成为影响HYP测定的主要因素，胶原水解的完全与否，由两个主要因素构成：（1）机械剪切组织的破碎程度；（2）盐酸水解的时间与温度。前者直接影响着后者，因不同组织的胶原含量不同，耐受剪切力必然不同，即使是相同组织，因病变而发生胶原含量的变化也会使相同的剪切力下破碎程度发生改变，直接影响进一步的水解程度及后续测定HYP含量的精确性。表1 两种方法对肝组织HYP含量的测定结果因此，我们在胶原水解过程中引入胃蛋白酶，其主要优点：（1）价廉；（2）最强的水解酶之一；（3）酸性条件下（pH 2.0）作用最强，利于蛋白的酸解；（4）提高水解速率。胃酶将蛋白水解成胨和多肽，为胶原进一步酸解提供了便利条件，加快了水解过程，本实验相同重量的肝组织经机械研磨后加入胃蛋白酶消化液后液体呈混悬状态，更有利于进一步水解。我们在相同条件下对两种方法进行了比较，结果显示胃酶酸解法与传统方法水解相同组织的HYP含量相差5倍，经统计学分析差异有显著性（P＜0.01），说明这种方法更敏感、更有应用价值，也更能反应真实的胶原中的HYP含量。此法在微量组织胶原测定中的优势更加明显，可使样品处理中的误差率减少，提高HYP检出率。
【参考文献】
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6 Pierce RA，Glaug MR，Greco RS，et al. Increased procollagen mRNA levels in carbon tetrachloride－induced liver fibrosis in rats. J Biol Chem, 1987,262(4):1652-1658.
作者单位：1 050082 河北石家庄，解放军白求恩国际和平医院检验实验中心（Δ通讯作者）
2 050082 河北石家庄，河北医科大学研究生学院
(编辑：张 彦)