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【摘要】 目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对大鼠胶质瘤生长的抑制作用。 方法 所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区接种1.0×106胶质瘤细胞。治疗组接种C6胶质瘤细胞后24 h内用PCNA反义寡核苷酸原位穿刺注射进行治疗，对照组只注射Hank’s液，每周1次，连续4周;观察两组大鼠肿瘤的一般情况与生存期。4周后断颈处死大鼠，完整地取下肿瘤，测量肿瘤体积，计算其抑瘤率。 结果 PCNA-ASODN治疗组大鼠胶质瘤的生长明显受到抑制，抑瘤率为64.5%。 结论 PCNA反义寡核苷酸对胶质瘤的生长具有抑制作用，通过反义技术可抑制靶基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞的增殖。
【关键词】 PCNA;反义寡核苷酸;胶质瘤
The experimental study of PCNA antisense oligonucleotides on inhibiting rat glioma growth
YU Xiao-ling， ZENG Gu-qing,YANG Na.
The First People’s Hospital of Xiangtan,Hunan Xiangtan 411101,China
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect of PCNA antisense oligonucleotides on the growth of rat glioma. Methods 1.0×106 glioma cells were cultured and seeded into right caudate nucleus of all rats with stereotactic technique. The treated group was given PCNA-ASODN once a week at 24 hours after cells inoculation . The control group was just treated with Hank’s liquid once a week for four weeks. The volume of tumors were measured. The inhibition rat of tumor growth was calculated. Results The tumor growth of PCNA-ASODN group(2.68±0.48 mm3) was significantly inhibited.The inhibition rate of tumor growth of the PCNA-ASODN group was 64.5%. Conclusion It was demonstrated that the growth of glioma in rat can be inhibited by PCNA antisense oligonucleotides, the expression of PCNA target gene and prolification of glioma cells can be inhibited by PCNA antisense oligonucleotides.
【Key words】 PCNA;antisense oligonucleotides; glioma
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。长期以来，胶质瘤的治疗一直是困扰着神经科医生的一道难题。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)的合成和表达与细胞增殖状态有关，它直接反映着细胞的增殖活性。我们利用近年来兴起的反义技术，以增殖细胞核抗原为治疗靶点，针对PCNA设计其反义寡核苷酸，观察了PCNA-ASODN对胶质瘤的抑制作用。为胶质瘤的治疗寻找新的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 细胞和细胞培养 C6大鼠脑胶质瘤细胞系购自中南大学。用含10%小牛血清的DMEM细胞培养液，置37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中传代培养。在倒置显微镜下观察细胞生长情况，取对数生长期细胞用于 实验。
1.2 反义寡核苷酸的合成 PCNA反义寡核苷酸序列与PCNAmRNA中AUG起始密码子后的18位碱基序列互补［1］ 。反义寡核苷酸（ASODN）的序列：5’-GACCAGGCGCGCCTCGAA-3’。由上海生工生物工程公司合成，并进行硫代修饰。
1.3 实验动物 纯种SD雄性大鼠，二级动物，鼠龄4～6 周，体重250～280g，共12只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
1.4 大鼠C6脑内胶质瘤模型的建立 大鼠经2%戊巴比妥钠（0.04g/kg）腹腔注射麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪（上海产，江湾I型）头架上。选大鼠右侧脑尾状核为靶点，其坐标为大囟中点前 1.0mm，矢状缝右旁开 3.0～3.5mm，硬膜下 5.0mm。手术暴露颅骨标志，按坐标定位，用牙科磨钻钻孔，孔径1.2mm，深达硬脑膜。将微量注射器固定于立体定向仪，进针深度为硬膜下6mm。按每只鼠1.0×106细胞悬液20μl于10min内注入靶区，留针5min，使细胞充分沉积。缓慢拔针后用骨腊封闭骨孔，缝合皮肤［2］。
1.5 治疗方法 按随机数字表法将12只SD大鼠随机分为两组，每组6只。 (1) PCNA反义寡核苷酸治疗组(PCNA-ASODN组)：接种后24h内在立体定向导引下原位穿刺靶点注射溶于20μl Hank’s液的PCNA反义寡核苷酸(含ASODN 200μg)，每周1次，连续治疗4周。(2)对照组：同法注射等容积的Hank’s液。
于治疗4周后处死大鼠，将肿瘤完整取下，测量肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=1/2ab2计算肿瘤体积。计算治疗组的抑瘤率，抑瘤率=(对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积)／对照组肿瘤体积×100%。
1.6 统计学分析 采用SSPS10.0软件统计包对数据进行处理，采用方差分析和t检验。
2 结果
2.1 大鼠的一般情况及存活期观察 12只大鼠脑内接种C6胶质瘤细胞的成功率为100%。接种鼠自接种第3天自行觅食。对照组术后8～14天出现精神萎靡，食欲不振，偏瘫，生长缓慢，3周时死亡1只，4周时死亡2只，其余3只处于濒死状态。治疗组大鼠则相对较活泼，毛色较鲜亮。
2.2 肿瘤体积与抑瘤率的变化 病理解剖可见，各组大鼠右尾状核区均有团块状肿瘤形成，并向周围脑组织浸润性生长。对照组肿瘤中心有出血坏死。两组大鼠的肿瘤体积及抑瘤率见表1。由表1可知，治疗组瘤体的生长速度明显慢于对照组，与对照组比较在统计学上差异有显著性(P＜0.01)，且治疗组对肿瘤有明显的抑制作用，抑瘤率达64.5%。
表1 对照组与治疗组的肿瘤体积和抑瘤率 略
3 讨论
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)与细胞增殖密切相关，被作为观察细胞增殖活性的重要指标；它在DNA复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥重要作用，出现在所有增殖期的细胞核中，是细胞增殖的标志。本实验结果表明，对照组大鼠自第2周开始出现食欲逐渐下降，精神萎靡，偏瘫，生长缓慢等情况，第3周出现濒死状态，肿瘤生长速度均较快，体积较大，为(7.55±0.60)mm3。PCNA-ASODN组与对照组比较，大鼠相对较活泼，毛色较鲜亮；肿瘤生长缓慢，体积较小，为(2．68±0.48)mm3，抑瘤率为64.5%。由此可见，通过原位穿刺注射PCNA-ASODN能够较好地抑制大鼠胶质瘤的生长。本实验将PCNA作为反义核酸治疗的靶分子，所用的PCNA反义寡核苷酸序列与PCNAmRNA中AUG起始密码子后的18位碱基序列互补，特异性封闭PCNA基因表达，从而抑制胶质瘤瘤细胞的增殖，达到治疗胶质瘤的目的，为胶质瘤的基因治疗提供了实验依据。张蕾［3］等也证实反义寡核苷酸可抑制肿瘤的生长。由此可见应用基因药物反义寡核苷酸治疗肿瘤是可行的［4］。PCNA-ASODN有望成为临床胶质瘤的新型抗肿瘤药物。
【参考文献】
1 Jaskulski D，Deriel JK，Mercer WE，et al.Inhibition of cellular proliferation by antisense oligodeoxynucleotides to pcna cyclin.Science，1998，240:1544-1546.
2 李维方，张光霁，朱诚,等．VEGF反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤生长的时间与剂量的效应关系．肿瘤,2003，23（1）：42-44.
3 张蕾，温洪涛，张岚,等．Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用．中华病理学杂志,2005，34（7）：402-406.
4 Liu XF,Zhou XT,Zou SQ.Inhibition of hepatitis C virus-transfected cholangiocarcinoma by antisense oligodeoxynucleotide in nude mice. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2004,3(1):115-119.
作者单位：411101 湖南湘潭，湘潭市第一人民医院神经内科
(编辑：海 涛)