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【摘要】 目的 探讨环磷酰胺（CTX）节律化疗联合最大耐受量（MTD）化疗对小鼠Lewis肺癌(LLC)肿瘤生长、血管生成和远处转移的影响。方法 荷瘤小鼠随机分4组：分别为（1）CTX节律化疗组；（2）MTD组；（3）联合组（CTX节律化疗联合MTD化疗）；（4）对照组。观察各组肿瘤生长及肺转移情况，检测小鼠肿瘤组织和肺组织中CD34、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和趋化因子受体-4(CXCR4)蛋白的表达。结果 CTX节律化疗联合MTD化疗对小鼠LLC的肿瘤生长、血管生成和远处转移均有显著的抑制作用。联合组和节律组的微血管密度(MVD)、肺转移率、MMP-9和CXCR4蛋白的表达明显低于对照组和MTD组 (P<0.05)。结论 在MTD化疗的基础上联合节律化疗可明显抑制LLC的肿瘤生长、血管生成和远处转移。节律化疗有可能通过下调瘤组织中MMP-9和CXCR4蛋白的表达而发挥作用。
【关键词】 节律化疗 环磷酰胺 血管生成 基质金属蛋白酶-9 趋化因子受体-4
Experimental research on the antitumor effect of the metronomic combined with maximum tolerated dose chemotherapy
GAO Hui-xia,ZHOU Xi-shan,YAO Xiao-jian,et al.The First Affiliated Hospital of Zheng zhou University,Zhengzhou 450052,China
【Abstract】 Objective To detect the effect of cyclophosphamide（CTX） administered by means of metronomic chemotherapy combined maximum tolerated dose （MTD） chemotherapy on the angiogenesis, carcinogenesis and metastasis of Lewis lung cancer(LLC) on C57BL/6 mouse model. Method The mice were randomly divided into four groups:（1）metronomic chemotherapy group,（2）MTD group,（3）combination group（metronomic chemotherapy combined MTD group）,（4）control group. Tried to deserve the tumor growth and lung metastasis of every group and detect the expression of CD34, MMP-9 and CXCR4 in tumor tissue and lung. Results CTX administered by metronomic chemotherapy combined with MTD inhibited significantly tumor growth, angiogenesis and metastasis of LLC. The MVD, lung metastasis rate, expression of MMP-9 and CXCR4 of combination group and metronomic group were much lower than control group and MTD group (P<0.05). Conclusion Based on MTD chemotherapy, CTX administered by concurrent metronomic chemotherapy, appears to inhibit significantly tumor growth, angiogenesis and metastasis of LLC. Potentially, by means of down regulating the expression of MMP-9, and CXCR4 in tumor tissue, metronomic chemotherapy performs.
【Key words】 metronomic chemotherapy; cyclophosphamide（CTX）; angiogenesis; matrix metalloproteinase-9（MMP-9）; chemokine receptor-4（CXCR4）
近年来发现低剂量、高频度的节律化疗对肿瘤血管内皮细胞及其前体细胞具有破坏作用而表现出极好的抗血管生成作用。在我们以前的实验中，发现环磷酰胺（CTX）最大耐受量（MTD）化疗对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用优于节律化疗，而节律化疗的不良反应轻且有明显的抗血管生成作用。据此推测如果把节律化疗联合MTD化疗有可能会进一步提高疗效。本报告研究了联合两种用药方法对肿瘤的抑制作用，同时探索节律化疗的转移抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料 瘤株：Lewis肺癌细胞株（LLC），由上海市肺科医院肺癌免疫研究室惠赠。试剂：CTX粉针剂（0.2g/瓶）；CD34一抗, CXCR4一抗, SABC免疫组化染色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司; MMP-９一抗，Santa公司； SP-9003免疫组化染色试剂盒，Zymed公司。动物：C57BL/6纯系小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～22g，河南省实验动物中心提供。
1.2 荷瘤动物模型的建立 将传代2周的荷瘤鼠断颈处死，无菌条件下剥出瘤块制成肿瘤细胞悬液，每只C57BL/6小鼠右腋部皮下接种0.2ml（含瘤细胞数2×106个）。
1.3 实验流程 分组和用药：随机将荷瘤鼠分4组：（1）CTX节律化疗组：腹腔注射CTX 35mg/kg，隔天1次；（2）MTD组：腹腔注射CTX 150mg/kg，隔天1次，共3次，21天1周期；（3）联合组：腹腔注射CTX 150mg/kg，隔天1次，给药3次后休息5天，从第11天开始CTX 35mg/kg，隔天1次，共5次；（4）对照组：腹腔注射生理盐水0.2ml，隔天1次。每组10只小鼠。以上各组均于肿瘤接种后第9天（瘤体400～700mm3）起连续给药20天。
从接种后第9天开始，隔日测量瘤块最长径（a）和与其垂直的短径（b），按照公式V(mm3)=ab2/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。从第9天开始，隔日称小鼠体重。第30天，处死小鼠剥离瘤体并称重。用免疫组化法染色计数肿瘤组织和肺组织内微血管密度（MVD）、MMP-9和CXCR4表达情况。
1.4 结果判定 MVD判定标准：低倍镜下找血管密度最高区， 5个高倍镜视野下计数被染色血管的平均数目。任何被CD34抗体染成棕黄色的单个细胞或细胞团，不管是否形成管腔，只要与周围组织有清楚的分隔都可计数，血细胞和大的血管腔不计。MMP-9判断标准：胞浆或胞膜出现棕黄色或黄色为阳性细胞,表达强度由染色细胞数和染色深度共同评分。阳性细胞染色深度按无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别打0、1、2、3分,阳性着色面积按无着色、着色<1/3、着色1/3～2/3、着色>2/3分别打0、1、2、3分。两积分之和由高到低分4级,6分( + + + ),4～5分( + + ),2～3分( + ),0～1分( - )。CXCR4判断标准：阳性细胞百分率:≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别为0、1、2、3、4分；着色强度：无着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别为0、1、2、3分，两者积分乘积：0阴性( - ) , 1～2弱阳性( + ) ,3～4阳性( + + ),≥5强阳性( + + + )。［注:（-）、(+）为低表达组,（++）、（+++）为高表达组］。
1.5 统计学处理 统计学方法应用SPSS12．0统计软件。采用方差分析和χ2 检验。
2 结果
2.1 各组小鼠体重变化,处死后瘤重 对照组小鼠体重增长较快, CTX节律化疗组增长缓慢, MTD组先下降后快速增长,联合组先下降后缓慢增长。处死后各组小鼠平均瘤重:对照组(13.52±1.26)g,节律化疗组(6.57±0.72)g, MTD组(4.65±0.43)g,联合组(2.03±0.34)g。节律化疗组、MTD组、联合组与对照组相比差异有显著性（P＜0.01）。
2.2 各组小鼠肿瘤生长情况 对照组小鼠肿瘤生长迅速,生长曲线陡直, CTX节律组生长曲线较平缓, MTD组肿瘤先缩小后迅速生长,联合组肿瘤先缩小后缓慢生长，生长曲线如图1所示。
2.3 剥出肿瘤的大体情况 对照组剥出肿瘤时出血较多，均见肿瘤侵犯胸壁及皮肤,肿瘤切面坏死少肿瘤生长比较活跃。MTD组8只侵犯胸壁，均侵犯皮肤，出血较多。联合组和节律组肿瘤包膜较完整。节律组肿瘤稍大，均见皮肤侵犯,联合组肿瘤小有6只见侵犯皮肤，联合组和节律组肿瘤均未侵犯胸壁，两组肿瘤切面坏死较多，出血较少。图1 肿瘤生长曲线2.4 各组小鼠肺转移情况 在剥出小鼠肺时可见对照组和MTD组有明显的肺转移现象，而节律组和联合组没有，差异有显著性（P＜0.05），见表1。表1 各实验组小鼠肺转移情况
2.5 各实验组免疫组化微血管计数 节律化疗组和联合组肿瘤组织内MVD明显低于对照组和MTD组，差异有显著性（P＜0.01），见表2。表2 各组肿瘤组织中微血管计数比较
2.6 各实验组MMP-9、CXCR4表达情况 节律组和联合组瘤组织和肺组织内MMP-9、 CXCR4的强阳性表达率低于对照组和MTD组，差异有显著性（P＜0.05）,见表3。表3 各组肿瘤组织中MMP-9、 CXCR4表达比较
3 讨论
近年研究发现高频率、低剂量、低毒性的节律化疗有明显的抗血管生成作用。我们以前的研究也证实了CTX节律化疗抗血管生成作用明显，但其早期的肿瘤抑制作用不如MTD化疗［1］。虽然MTD化疗也能杀伤肿瘤间质中的血管内皮细胞，但MTD化疗毒性大，需要较长的恢复期，在恢复期后期血管内皮细胞得以修复，肿瘤又迅速生长。因此本研究将CTX节律化疗与MTD化疗联合以期达到更好的治疗效果。
本研究结果发现，在MTD化疗的间歇期后期增加节律化疗能明显抑制肿瘤的生长。光镜下可以看到，联合化疗组和节律组肿瘤组织内MVD明显低于MTD组和对照组，再次证实了抗血管生成作用。更重要的是在我们的研究中发现，联合组和节律化疗组的肺转移率明显低于MTD组和对照组，免疫组化结果显示联合组和节律化疗组肿瘤组织和肺组织内CXCR4和MMP-9的表达明显降低。因此认为，CTX节律化疗除有抗血管生成作用外，还有明显的抗肿瘤转移作用。
趋化因子受体-4（CXCR4）为一种G蛋白耦联受体，CXCL12是目前已知唯一与CXCR4结合并激活的天然趋化因子。Phillips 等［2］证实CXCL12-CXCR4 生物学轴在非小细胞性肺癌的器官特异性转移中发挥重要作用。炎症细胞因子,如IL-1、TNF、IL-8是NF-κB的潜在诱导剂,而NF-κB则是CXCR4的潜在诱导剂［3］。而且在我们以前的研究中发现节律化疗能明显的抑制小鼠肿瘤组织中NF-κB的表达［4］。MMP-9是MMPs家族中的重要成员，能降解破坏ECM和BM，与肿瘤的浸润转移密切相关［5］，而且有研究报道CXCL12 作用于CXCR4促进肿瘤分泌MMP-9［6］。由我们的研究结果推测，CTX节律化疗可能是直接抑制了肿瘤组织和肺组织内CXCR4和MMP-9蛋白的表达，从而抑制了基底膜的降解，减少了肿瘤细胞的迁移，同时破毁了肿瘤赖以生存的环境，使转移至靶器官的肿瘤细胞难以存活而抑制了转移；或者是抑制了NF-κB的表达并通过NF-κB、CXCR4和MMP-9之间的相互作用而间接的发挥作用。
虽然我们的研究结果还不能阐明节律化疗抗转移的作用机制，但是它进一步丰富和拓展了节律化疗的作用机制。为抗转移治疗提供了一定的研究基础，为临床上手术或放疗后的肿瘤病人应用节律化疗预防转移提供了实验室依据。
【参考文献】
1 王云，梁宪斌，纪媛媛，等. 环磷酰胺节律化疗的抗血管生成作用探讨.山东医药,2005,46(6):17-19.
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4 韩颖，周芳，蔡政，等.紫杉醇节律化疗抗Lewis肺癌血管生成作用的实验研究.肿瘤基础与临床，2007，20(4):277-279.
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6 Kang H,Mansel R,Jiang W.Genetic manipulation of stromal cell- deri- ved factor-1 attests the pivotal role of the autocrine SDF- 1- CXCR4 pathway in the aggressiveness of breast cancer cells. Int J Oncol, 2005,26: 1429-1434.
作者单位：450052 河南郑州，郑州大学第一附属医院（Δ通讯作者）